- LẬP BẢN ĐỒ CÁC TÍNH TRẠNG SỐ LƯỢNG LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MẶN CỦA LÚA Ở GIAI ĐOẠN MẠ Hồ Viết Thế 1 , Thomson Michael J. - 2 Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI, Los Banos, Laguna, Philippines. - Bản đồ QTL, lúa, giai đoạn mạ, chịu mặn, chỉ thị microsatellite. - Quần thể lúa ở thế hệ F 3 gồm 400 cá thể con từ tổ hợp lai Kalarata và Azucena được sử dụng để lập bản đồ liên kết gene với tổng cộng 100 chỉ thị phân tử SSR được sử dụng. - Bản đồ liên kết thu được bao phủ 1.405 cM với khoảng cách trung bình giữa các locus là 14,05 cM. - Sau khi đánh giá trong môi trường dinh dưỡng Yoshida với độ mặn 12 dSm -1 bằng cách bổ sung NaCl, tổng cộng 8 tính trạng số lượng (Quantitative Trait Loci -QTL) liên kết chặt với khả năng chịu mặn của lúa ở giai đoạn mạ đã được xác định thông qua 5 tính trạng khảo sát và các QTL này tập trung chủ yếu ở phần đầu của nhiễm sắc thể số một. - Những QTL được phát hiện trong nghiên cứu này là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phục vụ cho công tác lai tạo giống kháng mặn có sự trợ giúp của các chỉ thị phân tử.. - Một trong những trở ngại lớn nhất đối với khả năng sinh trưởng phát triển của cây lương thực quan trọng này là sự nhiễm mặn.. - Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra khả năng kháng mặn ở lúa là tính trạng số lượng do nhiều gene khác nhau tác động tạo nên và chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện môi trường (Koyama et al., 2001. - Haq et al., 2008). - Như vậy, việc kết hợp chỉ thị phân tử MAS (Marker assisted selection). - Những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực tin sinh học và việc hoàn thành giải mã bộ gene cây lúa thì phương pháp lập bản đồ QTL (quantitative trait loci (QTL) mapping) được sử dụng nhiều để xác định những gene liên quan đến các tính trạng số lượng (Yano and Sasaki, 1997) và đặc biệt là xác định các vùng nhiễm sắc thể liên quan đến khả năng chịu mặn của cây lúa. - Trong đó, chỉ thị SSR (microsatellite. - marker) đã được sử dụng hiệu quả để xác định các QTL liên quan đến khả năng chịu mặn của lúa ở những tổ hợp lai khác nhau (Lang et al., 2000. - Ren et al. - Haq et al., 2008).. - Mặc dù đã có nhiều công trình được thực hiện để xác định các QTL liên quan đến khả năng kháng mặn từ những giống lúa khác nhau, ví dụ từ giống Pokkali (Bonilla et al., 2002) và giống Nona Bokra (Lin et al., 2004), nhưng ứng dụng của những QTL này trong thực tế tạo giống vẫn còn hạn chế vì khi chuyển sang cây con khả năng chịu hạn của những QTL này thấp hơn thực tế ở cây bố mẹ (Gregorio et al., 2002). - Cho tới hiện nay, chỉ duy nhất QTL kháng mặn Saltol được ứng dụng rộng rãi trong công tác lai tạo để bổ sung tính trạng chịu mặn cho những giống lúa đang được canh tác rộng rãi nhưng kháng mặn yếu. - QTL Saltol được xác định nằm trên tay ngắn của nhiễm sắc thể số 1 của giống lúa Pokkali, QTL này có khả năng giúp cây lúa chống chịu với điệu kiện mặn ở giai đoạn cây con và nó chiếm khoảng 40% tổng khả năng kháng mặn của cây lúa (Bonilla et al., 2002). - Tìm ra những QTL mới có khả năng chịu hạn ở các giai đoạn khác nhau cho cây lúa ở những tổ hợp lai khác nhau là việc làm cần thiết vì hiện nay nhiều giống lúa có khả năng chịu mặn tốt chỉ ở một vài giai đoạn phát triển nhưng nhạy cảm ở những giai đoạn khác (Moradi et al., 2003). - Những QTL mới sẽ giúp cho những nhà chọn giống có thêm nhiều lựa chọn trong việc tạo ra những giống lúa có khả năng chịu mặn cao hơn ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng (Ismail et al., 2007. - Thomson et al., 2010).. - Nghiên cứu này nhằm xác định những QTL liên kết chặt với khả năng chịu mặn ở giai đoạn mạ của lúa sử dụng tổ hợp lai mới là Kalarata và Azucena.. - Các QTL tương quan chặt đến hàm lượng diệp lục trong lá, nồng độ K. - Với những kết quả đạt được, nghiên cứu này đặt nền tảng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định những gene cụ thể liên quan đến khả năng kháng mặn của lúa ở giai đoạn mạ. - Ngoài ra, kết quả cũng xác định được những chỉ thị phân tử có liên kết chặt tới tính trạng chịu mặn tạo tiền đề cho công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ thị phân tử với thời gian chọn tạo ngắn. - kết và xác định các QTL. - Kalarata là giống lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ với khả năng kháng mặn cao, trong khi đi đó giống Azucena có nguồn gốc từ Philippines với đặc tính chất lượng gạo thơm ngon nhưng mẫn cảm với mặn. - Hạt lúa nảy mầm sẽ được gieo trên dung dịch dinh dưỡng Yoshida (Yoshida et al., 1976) trong 14 ngày, sau đó dung dịch dinh dưỡng được bổ sung NaCl với độ mặn 6 dS m -1 (độ mặn 0,3%) trong 7 ngày, tiếp theo độ mặn được tăng lên 12 dS m -1 (độ mặn 0,6%) và duy trì trong 2 tuần.. - Sau khi tăng độ mặn lên 12 dS m -1 hai tuần, mẫu được thu để phân tích các chỉ tiêu sinh lý liên quan đến khả năng kháng mặn. - Nồng độ diệp lục được tính như sau:. - Để xác định các chỉ tiêu nồng độ Na + và K. - Sau đó nồng độ Na + và K + được đo bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (Perkins Elmer,. - được pha loãng với nước cất khử ion tới nồng độ 35 ng/µl và giữ lạnh ở -80 o C tới khi sử dụng. - Tổng cộng 200 chỉ thị phân tử SSR phân bố đều trên 12 cặp nhiễm sắc thể lúa được sàng lọc để tìm ra những chỉ thị đa hình giữa lúa bố mẹ.. - 8,8 µl nước cất khử ion và 2,0 µl DNA ở nồng độ 35 ng/µl. - 2.4 Lập bản đồ liên kết gene và phân tích QTL Số liệu thu nhận sau điện di được sử dụng để lập bản đồ liên kết gene với phần mềm QGENE 4.3.2 (Nelson, 1997). - Vị trí của các chỉ thị phân tử được sử dụng từ cơ sở dữ liệu GRAMENE (www.gramene.org) và Cornell map. - Các nhóm liên kết gene được xác định với chỉ số LOD (logarithm of odds) >3,0. - Tầm ảnh hưởng của từng QTL trong mỗi tính trạng được tính toán dựa trên chỉ số R 2. - Phần mềm QGENE cũng được sử dụng để xác định các chỉ thị phân tử liên kết với các QTL liên quan đến khả năng kháng mặn của lúa ở trên 12 cặp nhiễm sắc thể của lúa. - Zeng, 1994) được sử dụng để kiểm tra sự liên kết giữa dữ liệu kiểu gene và dữ liệu kiểu hình. - Phần mềm này cũng cho phép xác định các QTL và mức độ ảnh hưởng của kiểu gene bố hoặc mẹ lên sự biểu hiện tính trạng.. - 3.1 Ảnh hưởng của mặn lên các tính trạng sinh lý của cây lúa. - Qua phân tích các tính trạng liên quan chặt tới khả năng kháng mặn ở lúa như hàm lượng diệp lục trong lá, khả năng hấp thu Na. - Kết quả cho thấy ở hầu hết các tính trạng nghiên cứu này ở quần thể cây con có sự biến động rộng hơn sự phân bố của giống lúa bố mẹ, điều này có thể do sự phân bố không đồng đều của các allen từ cơ thể bố mẹ (Hình 1). - Tần suất phân bố của các cá thể trong một tính trạng theo gần phân phối chuẩn cũng chỉ ra đây là những tính trạng số lượng do nhiều gene từ cây bố mẹ quyết định. - Kết quả tương tự cũng được Nguyen (2001) phát hiện khi nghiên cứu khả năng kháng ngộ độc nhôm trên lúa và Haq et al. - (2008) khi nghiên cứu khả năng kháng mặn của lúa ở tổ hợp lai Co39xMoroberekan.. - Giá trị trung bình của số lượng diệp lục ở cây con gần với giá trị trung bình từ hai bố mẹ chứng tỏ rằng những allen từ 2 bố mẹ góp phần ngang nhau ở những tính trạng này. - Các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn cao của cây lúa như nồng độ K + trong rễ và trong thân có xu hướng nghiêng về phía cây bố Kalarata, trong khi đó các tính trạng liên quan đến khả năng nhiễm đối với điều kiện mặn như tỉ lệ Na + /K + cao của rễ và của thân có xu hướng lệch về phía cây mẹ Azucena.. - Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây khi cho rằng một trong những cơ chế kháng mặn ở lúa là khả năng hấp thu nhiều K + và hạn chế hấp thu Na + để hạn chế bị ngộ độc đối với kim loại này (Munns et al., 1983). - Một trong những nguyên nhân chính có thể làm cho giống mẹ Azucena mẫn cảm với điều kiện mặn là do khả năng hấp thu một lượng lớn Na + của nó, và kim loại này là nguyên nhân gây ra những tổn hại ở bộ lá dẫn đến cây sinh trưởng kém (Lin et al., 2004).. - Hình 1: Tần số phân phối của các tính trạng sinh lý ở thân và rễ lúa sau khi ngập mặn 2 tuần có bổ sung NaCl ở độ mặn 12 dS m -1 (độ mặn 0,6%) (A=Azucena, K= Kalarata). - 3.2 Lập bản đồ liên kết gene. - Thông qua việc khảo sát 200 chỉ thị phân tử, có tới 100 chỉ thị phân tử đa hình giữa hai giống lúa bố mẹ được phát hiện, các chỉ thị này lần lượt phân bố từ NST 1 tới NST 12 với số lượng các chỉ thị như sau: NST 1 (20 chỉ thị). - Sản phẩm PCR khuếch đại từ những chỉ thị đa hình này sau khi điện di có kích thước từ 80 đến 350 bp (Hình 2).. - Kiểu gene của quần thể F 3 và 2 bố mẹ được ghi nhận và đưa vào phần mềm QGENE 4.3.2 để xây dựng bản đồ liên kết dựa trên dữ liệu của các chỉ thị phân tử đa hình. - Sự phân bố của các chỉ thị phân tử trên toàn bộ gene cây lúa được biểu diễn trên Hình 3, với tổng cộng 100 chỉ thị phân tử độ bao phủ của chúng lên tới 1.405 cM và khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị phân tử là 14,05 cM. - Các chỉ thị phân tử tập trung nhiều ở nhiễm sắc thể số 1 với khoảng cách trung bình là 7,94 cM, trong khi đó nhiễm sắc thể số 2 có khoảng cách giữa các chỉ thị xa nhất, trung bình là 56 cM. - Bản đồ liên kết trong nghiên cứu này có mật độ cao hơn và bao phủ tốt hơn so với một số nghiên cứu trước. - Ví dụ năm 2004, Masood et al. - sử dụng 74 chỉ thị RFLP để lập bản đồ QTL kháng mặn trên lúa;. - và năm 2006, Long-zhi et al. - sử dụng 97 chỉ thị SSR để lập bản đồ khả năng chịu lạnh ở lúa trong giai đoạn nảy mầm. - Tuy nhiên, ở nghiên cứu của chúng tôi vẫn còn một số vùng chưa được bao phủ tốt như nhiễm sắc thể số 2, số 9 và số 10. - Rõ ràng những khoảng cách lớn giữa các chỉ thị phân tử có thể dẫn đến việc bỏ qua một số QTL tiềm năng đối với tính trạng nghiên cứu, tuy nhiên do sự giới hạn của các chỉ thị phân tử đa hình giữa cặp lúa bố mẹ, những khảo sát tiếp theo đang tiếp tục được tiến hành để bổ sung thêm các chỉ thị phân tử vào những vị trí có khoảng cách xa này.. - Hình 3: Bản đồ liên kết và vị trí của các QTL từ thế hệ F 3 của tổ hợp lai Kalarata/Azucena Thông số bên phải nhiễm sắc thể là tên của chỉ thị SSR và thông số bên trái là vị trí của chỉ thị trên nhiễm sắc thể.. - NST: nhiễm sắc thể. - Logarithm of the odds ratio (LOD) là một chỉ tiêu quan trọng trong việc xác định độ tin cậy của một QTL được phát hiện, giá trị LOD biểu thị xác suất của QTL xảy ra trong vùng chỉ thị được khảo sát, như vậy LOD càng cao thì xác suất của QTL hiện diện ở vùng có chỉ thị phân tử càng lớn. - 3.0, điều này có nghĩa chỉ những QTL liên kết với tính trạng khảo sát có độ tin cậy cao hơn sự xuất hiện của các liên kết ngẫu nhiên 1000 lần trở. - Với yêu cầu này, tam QTL liên kết với năm tính trạng được nghiên cứu có LOD>. - 3.0 được phát hiện (Bảng 1) bao gồm QTL liên quan đến hàm lượng diệp lục B (dlb5.1), nồng độ K + ở thân (ndkt1.1), nồng độ K + ở rễ (ndkr11.1, ndkr11.2), nồng độ Na + ở thân (ndkt1.1), và tỉ lệ Na + /K + ở thân (tlnkt1.1, tlnkt4.1, tlnkt12.1). - Các QTL liên quan đến các tính trạng khác diệp lục a, hàm lượng Na + trong rễ chưa được phát thiện điều này có thể do những tính trạng này được điều khiển bởi rất nhiều locus với tác động nhỏ dưới ngưỡng phát hiện của thuật toán được sử dụng.. - Bảng 1: Các QTL được phát hiện trong điều kiện ngập mặn giữa tổ hợp lai Kalarata/Azucena.. - Tính trạng NST Tên QTL Vị trị QTL Giá trị LOD. - Nồng độ K + ở thân 1 ndkt1.1 RM10772A 4.4 K 11.0. - Nồng độ K + ở rễ 11 ndkr11.1 RM26464 3.7 A 9.0. - Nồng độ Na + ở thân 1 ndnt1.1 RM10696B 9.5 A 22.0. - R 2 : Tỉ lệ biểu hiện từng QTL đến tổng biểu hiện của tính trạng tương ứng. - QTL ndkt1.1 liên kết với nồng độ K + cao ở thân được phát hiện trên nhiễm sắc thể số một, QTL này chiếm 11% của tính trạng này và có nguồn gốc từ giống kháng Kalarata. - Trong khi đó QTL ndnt1.1 liên kết với tính trạng nồng độ Na + cao ở trong thân cũng được phát hiện trên nhiễm sắc thể số một và có nguồn gốc từ cây mẹ Azucena mẫn cảm với mặn, QTL này chiếm tới 22% độ biểu hiện của tính trạng đây có thể là nguyên nhân làm cho cây mẹ Azucena mẫn cảm với mặn vì nồng độ Na + cao là nguyên nhân chính dẫn tới sự phát triển kém của lúa, do nồng độ Na + cao quá sẽ dẫn tới cây lúa bị ngộ độc do các stress về áp suất thẩm thấu và nồng độ ion trong tế bào (Walia et al., 2005).. - Xác định được các QTL liên quan đến hàm lượng K + và Na + là kết quả quan trọng trong việc ứng dụng vào thực tế chọn tạo giống lúa. - Có tới 2 QTL đảm nhận việc duy trì nồng độ K + cao ở rễ ở nhiễm sắc thể 11, trong khi đó không phát hiện QTL đối với nồng độ Na + trong rễ và chỉ có một QTL cho nồng độ K + và một cho nồng độ Na + ở thân nằm trên nhiễm sắc thể số 1. - Ngay từ 1993, Gregorio và Senadhira đã phát hiện hai nhóm gene liên quan đến khả năng hấp thu Na + và K. - trong đó một nhóm liên quan đến khả năng loại bỏ Na + ra khỏi tế bào và nhóm còn lại kiểm soát việc hấp thu ion K. - Gần đây hơn, Koyama et al. - với vị trí của QTL chịu mặn Saltol đã được phát hiện trước đây nằm ở vị trí từ 43,2 và 65,6 cM (Thomson et al., 2007) và có chỉ số R 2 lần lượt chiếm và 43,2% biểu hiện của các tính trạng nồng độ Na. - nồng độ K + và tỉ lệ Na + /K + (Bonilla et al. - Việc nhiều QTL liên quan đến các tính trạng khác nhau nằm cùng một vị trí trên nhiễm sắc thể số 1 chứng tỏ rằng những tính trạng này có chức năng liên quan tới nhau. - Các tính trạng có thể do một gene hoặc do nhiều gene liên kết chặt với nhau kiểm soát. - Kết quả tương tự được phát hiện bởi Koyama et al. - (2001) khi nhóm nghiên cứu xác định nhiều QTL kiểm soát nồng độ K. - khả năng hấp thu Na + và tỉ lệ Na + /K + ở khu vực nhiễm sắc thể này.. - Lập bản đồ QTL chịu mặn của cây lúa là việc phân tích thống kê để tìm ra sự liên kết giữa các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn và sự tần số xuất hiện của các chỉ thị phân tử trong kiểu gene của các cá thể lúa trong một tổ hợp lai. - Trong nghiên cứu này, tám QTL được phát hiện liên kết chặt tới năm tính trạng kháng mặn của cây lúa ở giai đoạn mạ bao gồm dlb5.1, ndkt1.1, ndkr11.1, ndkr11.2, ndnt1.1, tlnkt1.1, tlnkt4.1, và tlnkt12.1.. - Những QTL phát hiện trong nghiên cứu này có thể ứng dụng trong công tác lai tạo giống lúa chịu mặn, hoặc có thể dùng để xác định những gene cụ thể liên quan đến cơ chế kháng mặn của lúa ở giai đoạn mạ. - Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp theo cần tiếp tục được thực hiện để bổ sung thêm nhiều chỉ thị phân tử vào những vị trí còn trống trên bản đồ liên kết để nâng cao mức độ chính xác của việc phát hiện QTL cũng như có thể phát hiện được những locus có tác động nhỏ tới các tính trạng chịu mặn. - Cần phát triển quần thể NIL (Near-isogenic line) lớn hơn để thực hiện thực hiện fine mapping cho những QTL đã được phát hiện trong nghiên cứu này, từ đó có thể sử dụng hiệu quả hơn trong công tác lai tạo giống lúa kháng mặn.. - Staples and G.H Toenniessen