- MỨC ĐA BỘI THỂ CỦA TẬP ĐOÀN GIỐNG CÂY CÓ MÚI Ở VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP. - DÒNG CHẢY TẾ BÀO. - Đề tài nhằm khảo sát mức độ đa bội thể 107 mẫu cây tự nhiên thuộc 4 nhóm chính: nhóm bưởi (Citrus maxima). - và nhóm chanh (Citrus aurantifolia), hạnh (Citrofortunella microcarpa), cần thăng (Limonia acidissima) trong tập đoàn cây có múi ở Việt Nam đang được trồng tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. - Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry) sử dụng máy đo đa bội thể Partec Ploidy Analyser PA-I, Đức. - Tiến hành ly trích nội dung DNA nhân lá các mẫu cần khảo sát và đo khả năng tán xạ ánh sáng ở các hiệu điện thế khác nhau để xác định bộ nhiễm sắc thể của chúng. - Kết quả cho thấy 100% các cây được khảo sát, đều mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n), không có dạng đa bội nào. - Đặc biệt, chanh và cam không hạt cũng mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội.. - Từ khóa: cây có múi, dòng chảy tế bào, máy đo đa bội thể, mức đa bội, thể đa bội 1 ĐẶT VẤN ĐỀ. - Trái cây có múi là một trong những mặt hàng cây ăn trái rất được ưa chuộng không những trong nước mà còn ngoài nước. - Các giống cây có múi được trồng phổ biến đem lại nguồn thu nhập chính cho nông dân, như: cam Bố Hạ, cam xã Đoài, Vân Du, cam sành, bưởi Năm Roi, quít đường Bến Tre, quýt hồng Đồng Tháp…. - Tuy nhiên, nguồn cây giống có nhược điểm chung là nhiều hạt, tính trạng có hạt làm giảm giá trị thương mại của ngành công nghiệp cây có múi. - 1 Viện Nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ. - cây có múi không hạt là mục tiêu quan trọng đang được đặt ra cho công tác tạo giống.. - Chiến lược được đặt ra là làm sao tìm được nguồn giống cây có múi mang thể đa bội có sẵn trong tự nhiên làm nguồn nguyên liệu cho việc lai tạo giống không hạt sau này. - Trước đây, để phát hiện được các giống cây đa bội, người ta sử dụng phương pháp đếm nhiễm sắc thể. - Phương pháp này tỏ ra tốn thời gian, khó nhọc và thiếu chính xác mà quy trình thực hiện lại không đồng nhất cho các loại cây khác nhau (Martens và Reisch, 1988. - Vì vậy một phương pháp mới đã ra đời, đó là phương pháp ứng dụng dòng chảy tế bào (flow cytometry-FCM) để phân tích mức độ đa bội thể của sinh vật. - Đây là phương pháp được đánh giá là nhanh, đơn giản và hiệu quả trong những năm gần đây. - Leus (2005) đã sử dụng máy CA-II và PAS-III (Partec, Đức) để phân tích mức bội thể và phân loại 339 giống hoa hồng (Rosa sp.) tại vườn thực vật của Bộ môn Di truyền và Chọn giống, Đại học Ghent (Bỉ). - (2009) đã tiến hành lai khác loài giữa Citrus unshiu với Citrus sinensis bằng kĩ thuật dung hợp tế bào trần. - Phương pháp FCM đã tỏ ra khá hiệu quả khi được dùng để phân tích mức độ đa bội thể của sản phẩm con lai, khi kết quả thu được là 15 trong tổng số 102 cây con lai là tứ bội thể. - Và nguồn giống tứ bội (4n) này được sử dụng cho việc lai tạo ra cây tam bội (3n) không hạt.. - Hiện nay các tập đoàn giống cây có múi ở Việt Nam đạt chất lượng tốt rất phong phú. - Những nghiên cứu trên đặc tính hình thái, sinh lý và bộ gen của chúng đều đã được thực hiện, tuy nhiên việc nghiên cứu về mức độ đa bội thể của tập đoàn này còn bỏ ngỏ. - Vì vậy việc thực hiện “Khảo sát mức độ đa bội thể của tập đoàn giống cây có múi ở Việt Nam bằng phương pháp dòng chảy tế bào” nhằm xác định mức đa bội thể của tập đoàn cây giống này. - Trên cơ sở đó tìm ra một nguồn đa bội thể cây có múi có sẵn trong tự nhiên, nhằm hỗ trợ cho những nghiên cứu sau này trong việc tạo ra giống cây có múi không hạt.. - 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu. - Vật liệu: Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 107 mẫu bao gồm 38 mẫu bưởi (Citrus maxima), 21 mẫu quýt (Citrus reticulata), 34 mẫu cam (Citrus sinensis) và 14 mẫu thuộc nhóm chanh (Citrus aurantifolia), hạnh (Citrofortunella microcarpa), cần thăng (Limonia acidissima) do Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu mẫu. - Trên cơ sở tập đoàn giống cây có múi được thu thập từ nhiều tỉnh thành khác nhau của cả nước hiện đang được trồng và chăm sóc tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đề tài chọn ra khoảng 100 giống, mỗi giống thu từ 3-4 mẫu lá non ở nhiều vị trí khác nhau, lá khoảng từ 20-30 ngày tuổi, sạch bệnh.. - 2.2.2 Phương pháp trích và nhuộm nội dung DNA nhân từ lá cây - Lau sạch mẫu lá bằng cồn 70 0. - Lấy khoảng 0,5 cm 2 mẫu lá cho vào đĩa petri, cho 0,5 ml dung dịch nhuộm CyStain UV ploidy (chứa chất có tác dụng ly trích nội dung DNA nhân tế bào và chất nhuộm DAPI (4’ 6-diamidino-2-phenylindole) phát quang dưới đèn UV).. - Sau đó lọc dung dịch mẫu qua màng lọc Partec 30 μm CellTrics (Đức) và tiến hành đo mức đa bội thể trên máy Partec Ploidy Analyser PA-I.. - 2.2.3 Phương pháp thiết lập thông số cho máy Partec Ploidy Analyser PA-I Các mẫu đối chứng của 4 nhóm như sau: nhóm bưởi (Citrus maxima) mẫu đối chứng là bưởi 5 roi SH-P74. - Các mẫu này đã được xác định dưới kính hiển vi mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=18 - bộ nhiễm chuẩn của chi Citrus. - Tiếp theo, chúng được dùng để thiết lập thông số lưỡng bội cho máy đo đa bội thể.. - Tiến hành đo và hiệu chỉnh các thông số của máy cho đến khi biểu đồ thu được có dạng một đỉnh cao và nhọn, đồng thời cho giá trị trung bình hàm lượng DNA (mean DNA nuclei content) ổn định sau nhiều lần đo (khoảng 10 lần). - Giá trị các thông số của máy được thiết lập như sau:. - Mỗi mẫu khảo sát được phân tích lặp lại 3 lần. - Ghi nhận giá trị trung bình này của mỗi mẫu (C). - 2.2.4 Phân tích số liệu. - Mức độ đa bội thể của mẫu thí nghiệm tính theo công thức:. - C: Giá trị trung bình hàm lượng DNA nhân cây cần khảo sát. - Hình 1: Mẫu đối chứng bưởi 5 roi SH-P74. - Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào 1B. - C 0 : Giá trị trung bình hàm lượng DNA nhân cây đối chứng - N 0 : Mức đa bội của mẫu đối chứng. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích chung. - Các giá trị nội dung DNA nhân trung bình của các mẫu đối chứng như sau: bưởi 5 roi SH-P74, Mean C Hình 1A, B). - Hình 2: Mẫu đối chứng quýt đường SH-M54. - Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào 2B. - Sau khi phân tích bằng phương pháp dòng chảy tế bào sử dụng máy Partec Ploidy Analyser PA-I, kết quả xuất ra dưới dạng biểu đồ. - Nhìn chung, kết quả phân tích đa bội thể của bốn nhóm cây cho thấy: tất cả các mẫu khảo sát đều có mức đa bội là lưỡng bội (2n). - Một số biểu đồ phân tích xuất hiện đỉnh phụ nhỏ bên cạnh đỉnh chính ở vị trí 4n là do tế bào đang trong giai đoạn nhân đôi của quá trình nguyên phân. - Số liệu phân tích của 4 nhóm được thống kê thành các bảng sau:. - Hình 3: Mẫu đối chứng cam soàn SH-O58. - Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào 3B. - Hình 4: Mẫu đối chứng chanh Tàu. - Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào 4B. - Bảng 1: Kết quả phân tích đa bội thể nhóm bưởi (Citrus maxima). - TÊN C C/C 0 MỨC ĐA BỘI. - Bưởi Bình San đợt 1 SH-P n. - Bưởi Đoàn Làng đợt 3 SH-P n Bưởi đường lá cam đợt 3 SH-P77b n. - Bưởi long 4 Sơn đợt 3 SH-P29d n Bưởi long 7 Dỷ đợt 3 SH-P n. - Mẫu đối chứng phân tích nhóm bưởi là mẫu bưởi 5 roi SH-P74có giá trị mean C 0 =103.93 với thông số Par Gain:. - Bảng 2: Kết quả phân tích đo đa bội thể của nhóm quýt (Citrus reticulata). - Mẫu đối chứng phân tích nhóm quýt là mẫu quýt đường SH-M54 có giá trị mean C 0 =101.76 với thông số Par Gain:. - Bảng 3: Kết quả phân tích đa bội thể nhóm cam (Citrus sinensis). - Cam bù đợt 3 SH-O44b n. - Cam Campuchia đợt 3 SH-O n. - Cam chua đợt 3 SH-OS n. - Cam đường canh đợt 3 SH-M16b n. - Cam không hạt SH-O n. - Cam không hạt SH-O51c n. - TÊN C C/C o MỨC ĐA BỘI. - Cam sông con đợt 3 SH-O13d n. - Mẫu đối chứng phân tích nhóm cam là mẫu cam soàn SH-O58 có giá trị mean C 0 =99,89 với thông số Par Gain:. - Bảng 4: Kết quả phân tích đa bội thể của nhóm chanh (Citrus aurantifolia), hạnh (Citrofortunella microcarpa), cần thăng (Limonia acidissima). - Mẫu đối chứng phân tích nhóm chanh, hạnh, cần thăng là mẫu chanh tàu có giá trị mean C 0 =276.32 với thông số Par Gain: 615.. - Các hình minh hoạ mức đa bội thể của 4 mẫu khảo sát thuộc 4 nhóm bưởi, quýt, cam, chanh. - Các mẫu bưởi da xanh SH-P74, quýt đường SH-M54, cam soàn SH-O58, chanh Tàu đều có giá trị C/C 0 sắp xỉ 1. - Tương ứng đều mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội như mẫu đối chứng.. - Chanh tàu n. - Chanh không hạt gốc ghép chanh tàu n Hạnh trái tròn SH-F n Hạnh trái tròn SH-F42b n. - 3.2 Thảo luận về các mẫu không hạt trong nghiên cứu. - Với kết quả phân tích đa bội thể cam (hình 9) và chanh không hạt (hình 10) trong nghiên cứu cũng có mức bội thể là lưỡng bội (2n). - Điều này có thể giải thích, đặc tính không hạt trong các mẫu khảo sát không xuất phát từ nguyên nhân đa bội lẻ, mà có thể từ các nguyên nhân sau:. - Hình 5: Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào Bưởi da. - Hình 6: Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào Quýt. - Hình 7: Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào Cam. - Hình 8: Biểu đồ phân tích mức lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy tế bào. - Hình 9: Cam không hạt SH-O51c có mức. - đa bội thể 2n Hình 10: Chanh không hạt có mức đa bội thể 2n. - Ngoài ra, việc tạo thành cây không hạt trong tự nhiên cũng do sự thoái hoá các cơ quan sinh sản làm cho cây khó thụ phấn ở mẫu Chanh không hạt ở nhà vườn ông Nguyễn Văn Chiến, Châu Thành, Hậu Giang (nơi thu mẫu Chanh không hạt trong thí nghiệm).. - Phương pháp dòng chảy tế bào là một phương pháp khá mới và được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực trong đó phân loại hay đếm số lượng nhiễm sắc thể là một trong những ứng dụng rất tiện ích của kỹ thuật này.. - Kết quả nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và các cộng sự năm 2010 trên đối tượng dưa hấu đã xử lý với colchicine để tạo thể đa bội từ thể nhị bội, kết quả phân tích với máy Flow Cytometry cho thấy đã xác định được dạng dưa hấu tam bội (3n) và dưa hấu tứ bội (4n) so với cây dưa hấu đối chứng không xử lý colchicine (2n).. - Do vậy phương pháp phân tích dòng chảy tế bào đã trở thành một công cụ quan trọng và hữu hiệu trong việc đánh giá mức bội thể các đối tượng cần nghiên cứu.. - Khảo sát 107 giống cây có múi thuộc 4 nhóm: nhóm bưởi (Citrus maxima), nhóm quýt (Citrus reticulata), nhóm cam (Citrus sinensis) và nhóm chanh (Citrus aurantifolia), hạnh (Citrofortunella microcarpa), cần thăng (Limonia acidissima) trong tập đoàn cây có múi của Việt Nam được trồng tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, ĐHCT cho thấy 100% cây đều mang nhiễm sắc thể ở mức lưỡng bội (2n).. - Đặc biệt, cây không hạt cũng biểu hiện ở mức lưỡng bội 2n, chứng tỏ đặc điểm không hạt ở những cây khảo sát không bắt nguồn từ sự bất thụ do đa bội lẻ, mà do nguyên nhân khác.. - Dựa vào qui trình trích đã hoàn chỉnh, tiếp tục thực hiện khảo sát các giống cây còn lại trong tập đoàn cây có múi của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, cũng như mở rộng khảo sát các tập đoàn cây giống khác.