- NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN SỰ TỒN TẠI CỦA XẠ KHUẨN TRONG CHẾ PHẨM TỒN TRỮ DẠNG ĐÔNG KHÔ. - Chất phụ gia, chế phẩm đông khô, xạ khuẩn Keywords:. - Xạ khuẩn 54 là dòng xạ khuẩn triển vọng trong phòng trừ nhiều bệnh do nấm gây hại trên cây trồng. - Nghiên cứu các chất phụ gia giúp bảo vệ và cải thiện tế bào xạ khuẩn trong điều kiện đông khô là rất cần thiết cho việc ứng dụng xạ khuẩn trên diện tích rộng. - Nghiên cứu đầu tiên về chất phụ gia bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tồn tại trong điều kiện đông khô, kết quả đã ghi nhận gelatin 5% và 10%, sucrose 5% thể hiện hiệu quả bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM trong quá trình đông khô và sucrose 5% được chọn làm chất phụ gia bảo vệ tế bào xạ khuẩn trong quá trình đông khô cho các thí nghiệm tiếp theo. - Nghiên cứu tiếp theo về chất phụ gia giúp tế bào xạ khuẩn 54 RM hồi phục từ tình trạng đông khô về tình trạng tăng trưởng, thí nghiệm khảo sát sáu chất phụ gia glucose (5% và 10. - Kết quả các chất như sữa ít béo 10% và 20%, glucose 10% và mannitol 10% đều có hiệu quả phục hồi tế bào xạ khuẩn tốt hơn so với đối chứng. - Thí nghiệm khảo sát thời gian tồn trữ của chế phẩm xạ khuẩn 54 RM dưới dạng bột đông khô. - Kết quả sữa ít béo 10% và 20% là chất phụ gia tốt, có khả năng phục hồi tế bào tốt so với các nghiệm thức còn lại. - Chế phẩm xạ khuẩn 54 RM sau đông khô không giảm ý nghĩa về mật số sau 5 tháng tồn trữ ở nhiệt độ phòng.. - Nghiên cứu cải thiện sự tồn tại của xạ khuẩn trong chế phẩm tồn trữ dạng đông khô. - Trong đó, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật triển vọng trong phòng trị sinh học bệnh cây trồng (Yan Min et al., 2000). - Riêng ở Việt Nam, cũng có một số ghi nhận bước đầu về khả năng phòng trị của xạ khuẩn với một số vi sinh vật gây bệnh cây trồng như Pseudomonas solanacearum 222 (Đào Thị Lương và ctv., 2002). - Riêng xạ khuẩn 54 RM được phân lập từ đất ruộng trồng ớt tại Lương Phi - Tri Tôn - An Giang có khả năng hạn chế bệnh trên một số loại cây trồng: bệnh thán thư trên ớt (Tô Huỳnh Như, 2012), bệnh héo rũ cây mè (Đoàn Thị Kiều Tiên, 2012) và bệnh chết cây con trên cải bắp (Nguyễn Thị Thu Nga và Nguyễn Thị Mai Thảo, 2013) trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới. - Trên cơ sở đó, “Nghiên cứu cải thiện sự tồn tại của xạ khuẩn trong chế phẩm tồn trữ dạng đông khô” được thực hiện nhằm tìm ra chất bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tốt nhất trong điều kiện đông khô cũng như tìm ra chất phụ gia giúp tế bào xạ khuẩn 54 RM hồi phục từ tình trạng đông khô về tình trạng tăng trưởng và khảo sát mật số xạ khuẩn 54 RM trong bột đông khô sau thời gian tồn trữ. - 2.1 Nghiên cứu chất bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tồn tại trong điều kiện đông khô. - Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, gồm 9 nghiệm thức và 4 chất phụ gia (glucose. - gelantin), mỗi chất được khảo sát ở hai nồng độ (5% và 10%) và một nghiệm thức đối chứng không thêm chất phụ gia (Costa et al., 2000. - Cách tiến hành: Nhân nuôi xạ khuẩn 54 RM với môi trường MS (Mannitol soya flour) trong 7. - vô trùng cho vào đĩa để thu hoạch huyền phù bào tử xạ khuẩn. - Xác định mật số tế bào xạ khuẩn trong huyền phù bằng phương pháp pha loãng và chà trên đĩa môi trường MS, đếm số khuẩn lạc hình thành sau 3 ngày, từ đó xác định được mật số xạ khuẩn (cfu/ml).. - Bổ sung các chất phụ gia vào huyền phù xạ khuẩn trước khi đông khô: Rút 3 ml huyền phù xạ khuẩn + 3 ml dung dịch từng chất phụ gia có nồng độ gấp đôi cho vào ống falcon (50 ml) để thu dược huyền phù xạ khuẩn hòa trong dung môi chất phụ gia có nồng độ tương ứng gồm glucose (5%, 10%);. - gelatin (5%, 10%) trước khi đông khô. - Nghiệm thức đối chứng bổ sung 3 ml huyền phù xạ khuẩn + 3 ml nước cất thanh trùng. - Sau đó các nghiệm thức được đông khô bằng máy đông khô (Labconco) trong ba ngày ở áp suất 0,040 mbar với nhiệt độ - 50 0 C.. - Ghi nhận chỉ tiêu: Xác định mật số của xạ khuẩn 54 RM còn sống ở mỗi nghiệm thức sau khi đông khô bằng phương pháp pha loãng và chà đĩa chứa 10 ml môi trường MS, sau 3 ngày mật số khuẩn lạc hình thành trên đĩa Petri tương ứng từng nghiệm thức. - Đếm số khuẩn lạc hình thành x hệ số pha loãng để suy ra mật số tế bào xạ khuẩn trong mỗi nghiệm thức (cfu/ml).. - 2.2 Nghiên cứu chất phụ gia giúp tế bào xạ khuẩn 54 RM hồi phục từ tình trạng đông khô về tình trạng tăng trưởng. - Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại gồm 7 nghiệm thức, trong đó có 6 nghiệm thức bổ sung 3 chất phụ gia ở hai nồng độ khác nhau như: sữa ít béo (10%, 20. - mannitol (5%, 10%) và glucose (5%, 10%) và một nghiệm thức đối chứng không thêm chất phụ gia nhưng được bổ sung nước cất (Costa et al., 2000. - Cách tiến hành: Nhân nuôi xạ khuẩn 54 RM trên môi trường MS trên đĩa Petri. - Sau đó, cho chất bảo vệ (được tìm ra từ thí nghiệm 1) vào huyền phù xạ khuẩn. - Huyền phù xạ khuẩn 54 RM (6 ml) được đem đi đông khô bằng máy đông khô trong 3 ngày ở áp suất 0,040 mbar với nhiệt độ - 50 0 C.. - ở các nghiệm thức glucose, mannitol. - Riêng nghiệm thức sữa ít béo được chuẩn bị ở hai nồng độ 10% và 20%. - Bột xạ khuẩn 54 RM sau khi đông khô được bổ sung thêm các chất phụ gia là sữa, sucrose, glucose, mannitol đúng thể tích ban đầu là 6 ml. - Để yên huyền phù xạ khuẩn 54 RM trong 9 phút, sau đó pha loãng đếm mật số bằng phương pháp trải trên đĩa môi trường.. - Ghi nhận chỉ tiêu: Mật số của xạ khuẩn 54 RM (cfu/ml) ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp pha loãng huyền phù và chà trên đĩa chứa 10 ml môi trường MS, sau 3 ngày xác định mật số xạ khuẩn hình thành trên đĩa Petri của từng nghiệm thức. - Xử lý số liệu: Số liệu mật số xạ khuẩn 54 RM được chuyển sang log 10 và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC qua phép thử Duncan.. - 2.3 Khảo sát thời gian tồn trữ của chế phẩm xạ khuẩn 54 RM dưới dạng bột đông khô. - Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm nghiệm thức đối chứng (bột xạ khuẩn 54 RM sau khi đông khô không bổ sung chất phụ gia) và các nghiệm thức bổ sung thêm chất phụ gia hồi phục tế bào tốt nhất tìm thấy ở thí nghiệm 2. - Mỗi nghiệm thức gồm bốn lặp lại.. - Huyền phù xạ khuẩn 54 RM (6 ml) được đem đi đông khô bằng máy đông khô trong 3 ngày ở áp suất 0,040 mbar với nhiệt độ - 50 0 C. - Xác định mật số của xạ khuẩn 54 RM sống ở các thời điểm tồn trữ sau và 150 ngày sau đông khô bằng phương pháp pha loãng huyền phù vi sinh vật và đếm mật số trên môi trường MS bằng cách cho 6 ml dung dịch từng loại chất phụ gia (được tìm ra từ thí nghiệm 2) vào ống tube chứa bột xạ khuẩn đông khô, nghiệm thức đối chứng thêm nước cất tương ứng. - Để yên huyền phù xạ khuẩn 54 RM trong 9 phút sau đó xác định mật số tế bào xạ khuẩn sống bằng phương pháp pha loãng và chà đĩa trên môi trường MS.. - 3.1 Kết quả các chất phụ gia trong bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tồn tại trong điều kiện đông khô. - Log mật số xạ khuẩn 54 RM (cfu/ml) ban đầu trước khi đông khô là 12,07. - Kết quả khảo sát mật số xạ khuẩn ở các nghiệm thức có bổ sung chất bảo vệ sau đông khô. - Kết quả ở Bảng 1 cho thấy, 3 nghiệm thức gelatin 5%, gelatin 10%, sucrose 5%. - thể hiện được vai trò bảo vệ tế bào xạ khuẩn dưới điều kiện đông khô, với log (mật số xạ khuẩn cfu/ml) lần lượt là 12,06. - 12,02 và 12,04, cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng với log mật số xạ khuẩn (cfu/ml) là 11,38. - Các nghiệm thức còn lại glucose 5%, glucose 10%, sucrose 10% tuy cũng có mật số tế bào sống cao hơn, tuy nhiên không khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng. - Lactose 5% và 10% hoàn toàn không giúp tế bào tồn tại tốt hơn trong điều kiện đông khô so với đối chứng. - Đến năm 2011, Nguyễn Thị Kim Xuyến cũng ghi nhận đường sucrose 10% cho hiệu quả giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 23 1-1 tốt trong quá trình đông khô.. - giúp bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tồn tại tốt hơn. - trong điều kiện đông khô. - Chính vì thế, đường sucrose nồng độ 5% được chọn làm chất phụ gia bảo vệ tế bào xạ khuẩn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.. - Bảng 1: Mật số xạ khuẩn sau khi đông khô ở các nghiệm thức cộng thêm chất bảo vệ khác nhau. - STT Nghiệm Thức Mật số xạ khuẩn log (cfu/ml). - 3.2 Hiệu quả của chất phụ gia giúp tế bào xạ khuẩn 54 RM hồi phục từ tình trạng tiềm sinh sau đông khô về tình trạng tăng trưởng. - Kết quả ở Bảng 2 cho thấy, bốn nghiệm thức sữa ít béo (10% và 20. - glucose 10% và mannitol 10% có log (mật số cfu/ml) trong khoảng cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng với log (mật số cfu/ml) là 11,65, hai nghiệm thức là glucose 5% và mannitol 5% không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.. - Sữa ít béo được thêm vào sau quá trình đông khô cho kết quả tế bào xạ khuẩn phục hồi tốt, làm cho tế bào gia tăng khả năng sống. - Như vậy, qua thí nghiệm cho thấy các nghiệm thức sữa ít béo (10% và 20. - glucose 10%, mannitol 10% cho kết quả phục hồi tế bào tốt và khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng. - Bảng 2: Mật số xạ khuẩn sau khi được thêm vào các chất phụ gia giúp tế bào phục hồi sau quá trình đông khô. - STT Nghiệm thức Mật số xạ khuẩn log (cfu/ml). - 3.3 Kết quả khảo sát thời gian tồn trữ của chế phẩm xạ khuẩn 54 RM dưới dạng bột đông khô. - Nhìn chung, kết quả ở Bảng 3 thấy nghiệm thức sữa ít béo (10% và 20%) thể hiện được hiệu quả giúp tế bào phục hồi tốt, với mật số tế bào xạ khuẩn qua các thời gian khảo sát đều cao hơn và khác biệt ý nghĩa so nghiệm thức đối chứng. - Tại thời điểm 0 ngày sau đông khô (NSĐK) nghiệm thức sữa ít béo (10% và 20%) được ghi nhận khả năng phục hồi tế bào tốt có khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. - Nghiệm thức sữa ít béo 10% cho mật số cao nhất với log mật số (cfu/ml) là 10,97, tiếp theo là sữa ít béo 20% với log (mật số cfu/ml) là 10,66 trong khi đối chứng chỉ đạt log (mật số cfu/ml) 8,42.. - Nghiệm thức sữa ít béo 10% hoàn toàn khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng.. - Thời điểm 60 NSĐK, chỉ hai nghiệm thức sữa ít béo 10% và 20% về thể hiện khả năng giúp tế bào hồi phục tốt với log (mật số cfu/ml) đạt cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.. - Sau 90 NSĐK, các nghiệm thức có giảm mật số nhưng vẫn còn có hiệu quả phục hồi tế bào xạ khuẩn. - Tương tự thời điểm trước, nghiệm thức glucose 10% và mannitol 10%. - Tại thời điểm 120 NSĐK, các nghiệm thức có chứa chất bảo quản vẫn không khác biệt ý nghĩa thống kê với nhau, tương tự chỉ có nghiệm thức sữa ít béo 10% và 20% giữ mật số tế bào sống cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.. - Trong khi đó, hai nghiệm thức glucose 10% và mannitol 10% cho hiệu quả không khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng.. - Như vậy, sữa ít béo 10 % và 20% giúp phục hồi tế bào xạ khuẩn ở trạng thái sau đông khô tốt nhất.. - Thí nghiệm của Costa et al., (2000) cho thấy sử dụng sữa gạn béo 10% làm chất phụ gia giúp tế bào vi khuẩn hấp thụ nước sau khi đông khô đối với vi khuẩn Pantoea agglomerans và khả năng sống được của tế bào vi khuẩn này sau khi đông khô với sữa gạn béo đạt 100%.. - Bảng 3: Khả năng phục hồi của các tế bào xạ khuẩn qua các thời điểm khảo sát từ 0 đến 150 ngày sau đông khô. - STT Nghiệm Thức. - Mật số xạ khuẩn chế phẩm xạ khuẩn log (cfu/ml) 54 RM sau đông khô sau thời gian tồn trữ (NSĐK). - NSĐK: ngày sau đông khô Về thời gian tồn trữ của chế phẩm đông khô Qua Bảng 4 khi so sánh về thời gian tồn trữ của các sản phẩm xạ khuẩn đông khô của tất cả các nghiệm thức cho thấy trong cùng một nghiệm thức không có khác biệt ý nghĩa thống kê về mật số qua các thời gian tồn trữ được khảo sát. - Như vậy, phương pháp đông khô thể hiện hiệu quả trong tồn trữ tế bào xạ khuẩn ổn định qua 5 tháng ở nhiệt độ phòng. - Qua thí nghiệm thời gian tồn trữ xạ khuẩn cho thấy các tế bào xạ khuẩn được bảo vệ khi đông khô sau đó vẫn có khả năng hoạt động tốt khi được phục hồi. - Các nghiệm thức bao gồm glucose 10%,. - mannitol 10%, sữa ít béo 10% và 20% đều cho hiệu quả phục hồi tế bào xạ khuẩn. - Qua các thời điểm tồn trữ, tuy tế bào xạ khuẩn có giảm theo thời gian nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả phục hồi tốt, giảm ít hơn so với đối chứng. - Qua kết quả này thấy phương pháp đông khô giúp tế bào xạ khuẩn tồn tại được khá lâu, có thể mật số có giảm nhưng vẫn cho hiệu quả phục hồi tốt sau thời gian dài tồn trữ. - Nên phương pháp đông khô tế bào là một phương pháp tốt để có thể thực hiện tồn trữ tế bào một cách lâu nhất và tốt nhất đồng thời sữa là chất phụ gia cần thiết giúp hồi phục tế bào từ trạng thái tiềm sinh sau đông khô về tình trạng tăng tưởng.. - Bảng 4: Khảo sát khả năng phục hồi của chế phẩm trong từng nghiệm thức qua các thời gian 0 đến 150 ngày sau đông khô. - Mật số xạ khuẩn log (cfu/ml) các chất phụ gia được cho vào chế phẩm đông khô. - NSĐK: ngày sau đông khô. - Hình 1: Mật số tế bào xạ khuẩn trên các nghiệm thức xử lý các chất phụ gia sau khi đông khô được khảo sát thời gian 90 ngày sau đông khô (hình được chụp ở cùng nồng độ pha loãng 10 -6. - Gelatin 5% và 10%, sucrose 5% đều thể hiện hiệu quả bảo vệ tế bào xạ khuẩn 54 RM tốt trong quá trình đông khô.. - Sữa ít béo 10% và 20%, glucose 10% và mannitol 10% được ghi nhận hiệu quả phục hồi tế bào xạ khuẩn 54 RM tốt sau quá trình đông khô.. - Khảo sát thời gian tồn trữ của chế phẩm xạ khuẩn 54 RM với chất bảo vệ sucrose 5% và chất phụ gia sữa ít béo 10% và 20% dưới dạng bột đông khô, mật số chế phẩm xạ khuẩn 54 RM sau đông khô không giảm ý nghĩa trong 5 tháng tồn trữ ở nhiệt độ phòng.. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn kháng Pseudomonas solanacearum gây héo cây trồng. - Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum f.sp. - Hiệu quả của xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh chết cây con do nấm Rhizoctonia solani gây ra trên cây cải bắp. - vesicatoria) bằng xạ khuẩn trong điều kiện in vitro và nhà lưới. - Đánh giá khả năng đối kháng và hiệu quả phòng trị của xạ khuẩn đối với nấm Colletotrichum sp