- NGHIÊN CỨU CẤU TẠO TUYẾN NỌC ĐỘC VÀ MÔ HÌNH HÓA CẤU TRÚC KHÔNG GIAN 3D BẬC 3. - CỦA PROTEIN ĐỘC TỐ LOÀI ỐC CỐI CONUS TESSULATUS Nguyễn Thị Anh Thư 1 , Đặng Thúy Bình 1 và Phan Dũng 2. - Conus, răng kitin, tuyến độc, Ốc cối, cấu trúc không gian 3D protein. - Đặc điểm hình thái, giải phẫu tuyến độc tố, cấu trúc răng kitin, trình tự amino acid (a.a) và cấu trúc không gian bậc 3 của protein độc tố ốc cối Conus tessulatus (loài ăn giun biển) thu tại vịnh Nha Trang, Khánh Hòa được tiến hành trong nghiên cứu này. - tessulatus có túi độc màu trắng sữa hình lưỡi liềm, ống dẫn độc màu vàng nhạt, túi răng kitin màu cam hơi đỏ, răng kitin có cấu trúc mềm và kích thước nhỏ, có đường răng cưa, có 1 ngạnh. - Kết quả giải trình tự gen độc tố α- conotoxin được dùng để xây dựng trình tự a.a suy diễn của protein độc tố loài C. - Dựa trên trình tự a.a thu được, khung cystenin (CC-C- C) đặc trưng cho α-conotoxin được xác định và cấu trúc không gian 3D bậc 3 của protein độc tố được mô hình hóa nhằm tìm hiểu chức năng của α-conotoxin C. - Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu protein phục vụ cho ứng dụng trong quá trình sản xuất thuốc điều trị bệnh liên quan đến thần kinh.. - Ốc cối (Conus spp.) là một trong những loài động vật thân mềm có kích thước lớn gồm khoảng 700 loài (Cunha và ctv., 2005). - Ốc cối ăn mồi sống, có nọc độc, phân bố trong các rạn san hô trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm (Rockel và ctv., 1995). - Ngoài giá trị về kinh tế, các loài ốc cối còn được biết đến như là một nguồn dược liệu quý chữa các bệnh thần kinh, động kinh, ung thư và triệu chứng đau mãn tính (Olivera, 2002;. - Thức ăn chính của ốc cối (Conus spp.) là các loài cá nhỏ, động vật thân mềm, giun biển hoặc các loài ốc cối khác (Olivera, 2002. - Tùy thuộc vào con mồi mà phương thức tấn công, hình thái và cấu trúc răng kitin cũng khác nhau, loài ăn cá có 3 ngạnh với các đầu uốn cong. - Loài ăn giun biển có một ngạnh và một lưỡi, có đường răng cưa, eo răng, có cựa đáy (Franklin và ctv., 2007).. - Cơ quan đó chính là tuyến độc. - Tuyến nọc độc của ốc cối gồm các bộ phận: túi nọc độc, ống dẫn độc, vòi hút và túi răng kitin (Franklin và ctv., 2007).. - Theo Peng và ctv. - Peptie độc tố tách chiết từ C.. - Nghiên cứu này khảo sát hình thái tuyến nọc độc, cấu trúc, hình thái răng kitin của loài Conus tessulatus có phương thức dinh dưỡng ăn giun biển (Polychaete) tại Nha Trang, Khánh Hòa. - đồng thời xác định trình tự a.a của vùng độc tố, xây dựng mô hình cấu trúc không gian bậc 3 của protein nhằm làm sáng tỏ mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của độc tố để làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái. - Đo chiều cao vỏ, chiều cao tầng thân, chiều rộng, chiều cao tháp vỏ của từng cá thể ốc cối. - Ốc được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Röckel và ctv. - 2.2.2 Giải phẫu tách tuyến độc. - Để nghiên cứu răng kitin, dùng kéo cắt túi chứa răng kitin, sau đó tách các răng, rửa sạch bằng cồn đặt lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi có gắn camera và kết nối máy tính (Olympus BX45) ở vật kính 10×, chụp ảnh và đo kích thước (chiều dài răng và ngạnh răng).. - ARN tổng số của tuyến độc tố ốc cối được tách chiết bằng bộ kít tách chiết RNA IQ TM 2000 (GeneReach Biotechnology - Đài Loan). - Tuyến độc tố (khoảng 30mg) được nghiền nhuyễn trong dung dịch tách chiết RNA. - cDNA của tuyến độc tố ốc cối được tổng hợp bằng bộ kít tổng hợp cDNA của Công ty cổ phần Việt Á. - TCG TGG TTC AGA GGG TCC TGG 3’) (Lou và ctv., 2006) được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của đoạn propeptide và của vùng không dịch mã (3’UTR). - Khuẩn lạc có mang gen được chọn lọc bằng phương pháp sàng lọc trắng – xanh để chuẩn bị cho việc giải trình tự. - Các vector cho khuẩn lạc màu trắng có mang gen mã hóa cho các conopeptide tiền thân được giải trình tự và phân tích trên máy phân tích trình tự tự động. - Các trình tự được kết nối bằng phần mềm Vector NTI v.9.. - 2.2.6 Danh pháp và phân tích trình tự của họ α-conotoxin. - Trình tự DNA độc tố α-conotoxin thu được từ loài C. - Trình tự độc tố được xác nhận bằng chương trình BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Sau đó, sử dụng phần mềm chuyển trình tự nucleotide thành a.a (http://www.fr33.net/translator.php) và chọn frame không có các mã kết thúc, đồng thời có khung CC-C-C để phân tích.. - 2.2.7 Xây dựng cấu trúc không gian bậc 3 của protein từ trình tự a.a Ts1.1. - Sử dụng phần mềm Swiss-PdbViewer 4.1.0 (Nicolas và ctv., 2012) và phần mền Jmol (http://jmol.sourceforge.net/) để dự đoán cấu trúc bậc 3 của protein. - Server MOLPROBITY (http://molprobity.biochem.duke.edu/) được sử dụng để đánh giá chất lượng của mô hình cấu trúc protein của loài C. - 3.1 Cấu tạo tuyến độc tố và cấu trúc răng kitin Cấu tạo chung tuyến độc tố của các loài ốc gồm các bộ phận: túi độc có màu trắng sữa là cơ quan lớn nhất trong tuyến độc. - vòi hút hình chóp cụt, rỗng, là phần cuối cùng của tuyến độc. - túi răng kitin chứa các răng kitin bao gồm hai nhánh, nhánh dài có màu đỏ ở phần nối với ống dẫn và vàng nhạt ở phần còn lại, nhánh còn lại trong suốt. - Tuyến độc tố của loài Conus tessulatus (Hình 1A) được mô tả ở Hình 1B.. - Túi răng kitin có màu cam hơi đỏ CD 0,50±0,00 cm, KL 0,01±0,00 g (Hình 1A,1B, Bảng 1).. - Bảng 1: Khối lượng và chiều dài các bộ phận tuyến độc của ốc cối Conus tessulatus (n= 5) Khối lượng. - Toàn thân Tuyến độc Ống dẫn độc Túi độc Túi răng kitin Chiều dài. - Vỏ Tuyến độc Ống dẫn độc Túi độc Túi răng kitin Răng kitin Kết quả cho thấy có sự tương đồng với nghiên. - Theo Đặng Thúy Bình và ctv, (2012) nghiên cứu về loài C. - badanus cho thấy túi độc có màu trắng sữa, hình lưỡi liềm, răng kitin có cấu trúc mềm và kích thước nhỏ, có lưỡi răng và eo răng.. - Cấu trúc răng kitin. - Sau khi phân tách và làm sạch, răng kitin của loài C. - Răng kitin của C. - tessulatus có cấu trúc mềm và kích thước nhỏ, có đường răng cưa, có một ngạnh, CD 0,11±0,01 cm (n=5) (Bảng 1).. - Theo Đặng Thúy Bình và ctv. - (2013) răng kitin loài C. - Franklin và ctv. - Kết quả cho thấy cấu trúc răng kitin của loài nghiên cứu đại diện cho phương thức dinh dưỡng ăn giun biển có sự tương đồng với các nghiên cứu trước đây (Franklin và ctv., 2007. - Răng kitin của ốc cối (Conus ssp.) giống như kim tiêm trong suốt, có vai trò trực tiếp đưa chất độc vào cơ thể con mồi. - Răng kitin của ốc cối có ngạnh đầu, một số có ngạnh thứ hai, ngoài ra còn tìm thấy một số rất ít loài có ngạnh thứ ba, các ngạnh giúp giữ con mồi. - Lưỡi răng kitin có vai trò cắt và mở rộng diện tích tiếp xúc khi phóng kim tiêm vào con mồi. - Đường răng cưa là một dải răng nhỏ chạy dọc trong thành răng từ ngạnh đầu xuồng gần giữa răng kitin. - Phần eo răng kitin là một điểm co lại phần nửa trên của răng kitin. - Cựa ở đáy là một răng nhỏ nhô ra từ u nổi lên ở cuối răng kitin (Franklin và ctv., 2007. - Trình tự a.a của α-conotoxin. - Sản phẩm PCR được nhân dòng và giải trình tự, đoạn trình tự thu được có chiều dài là 153bp. - Tiền thân độc tố của loài C. - tessulatus được ký hiệu là Ts1.1 có chiều dài 42 a.a. - Vùng độc tố trưởng thành của Ts1.1 được phân tách với vùng tiền trưởng thành tại vị trí XR, có 20 a.a (Hình 2).. - Hình 2: Trình tự nucleotide và peptide của trình tự Ts1.1, Ký hiệu a.a theo danh pháp quốc tế. - 3.2 Xây dựng cấu trúc không gian bậc 3 của protein từ đoạn peptide Ts1.1. - Cấu trúc protein 3D của α-conotoxin của trình tự đoạn peptide Ts1.1 được trình bày ở Hình 3A, B, C.. - Hình 3: Cấu trúc không gian bậc 3 của trình tự a.a Ts1.1. - Thể hiện chủ yếu là các a.a có nhóm bên tích điện dương. - (B): Thể hiện các a.a có nhóm bên kỵ nước. - Các a.a có nhóm bên không phân cực, kỵ nước được ký hiệu bằng màu xanh lá cây. - các a.a có nhóm bên phân cực, không tích điện được ký hiệu bằng màu vàng. - các a.a có nhóm. - các a.a có nhóm bên tích điện âm được ký hiệu bằng màu xanh da trời. - các a.a có nhóm bên chứa nhân thơm được ký hiệu bằng màu đỏ Đánh giá mô hình cấu trúc protein của độc tố. - tessulatus có gốc Cysteine tạo nên liên kết disulfide với các gốc Cysteine tại vị trí khác nhau tạo thành cấu trúc xoắn của protein (Hình 3C), những cầu nối này đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc protein của độc tố α-conotoxin. - Trong các loop1 và loop2 thì chủ yếu là các a.a có nhóm bên kỵ nước. - Các liên kết disulfide khác nhau tạo ra cấu trúc với các nếp gấp khúc khác nhau dẫn đến chức năng của protein khác nhau, do vậy độc tố tác động lên các kênh ion khác nhau (Kang và ctv., 2006).. - Olivera (2002) cho rằng độc tố α-conotoxin của ốc cối tác động lên các kênh ion khác nhau, trong đó có kênh K + của tế bào thần kinh. - Nghiên cứu này tập trung đến các a.a có nhóm bên mang điện tích (K, H, R, D chiếm 25,6%) và kỵ nước (G, A, P, V, L, I chiếm 37.2%) (Hình 3B) để làm nổi bật. - lực hút khi đứng gần nhau, thông qua liên kết này các a.a kết hợp với nhau tạo thành khối, đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc protein và ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein (Alexei, 2002). - Bên cạnh đó, a.a có nhóm bên mang điện dương tạo nên vùng nhạy cảm điện thế, có thể di chuyển và kiểm soát mở kênh K. - Trong trình tự Ts1.1, các a.a có nhóm bên tích điện dương chia làm hai cụm, một là ở đầu N-terminal gồm a.a Arg5, hai là ở đầu C-terminal gồm a.a Arg41, Arg42, Arg43 (Hình 2), các a.a có nhóm bên tích điện dương này giúp cho độc tố tiếp cận với cửa kênh K + (Harvey và ctv., 2007).. - Annette và ctv. - (2003) nghiên cứu cấu trúc protein độc tố α4/7-conotoxin tác động lên thụ thể nAChR thu nhận từ Conus geographus, cho thấy cấu trúc protein có sự phân bố chủ yếu của các a.a có nhóm bên kỵ nước và tích điện, có các liên kết disulfide khung CC-C-C giúp ổn định cấu trúc protein và có sự phân bố của a.a Arg đầu khung N- terminal. - Mô hình cấu trúc protein của C.. - tessulatus trong nghiên cứu này tương đồng với mô hình cấu trúc protein của Conus geographus đã được nghiên cứu trước đây.. - Độc tố conotoxin từ ốc cối có tính đa dạng cao đoạn peptide được phát hiện) và có tiềm năng ứng dụng trong y dược. - Nghiên cứu hiện tại mô tả hình thái, cấu trúc tuyến độc và răng kitin, đồng thời xây dựng mô hình cấu trúc 3D của protein độc tố loài C. - Dữ liệu này góp phần quan trọng trong nghiên cứu dược tính của độc tố ốc cối, cũng như cung cấp thông tin cho công tác quản lý và bảo tồn nguồn dược liệu sinh học biển Việt Nam.. - Răng kitin có kích thước nhỏ và yếu, có đường răng cưa, có một ngạnh.. - Khung CC-C-C đặc trưng cho α-conotoxin được xác định và cấu trúc không gian 3D bậc 3 của protein độc tố loài C. - Cần có những nghiên cứu chuyên sâu về cấu tạo tuyến độc, cấu trúc răng kitin và cấu trúc protein độc tố để góp phần quan trọng trong nghiên cứu dược tính của độc tố ốc cối, cũng như cung cấp thông tin cho công tác quản lý và bảo tồn nguồn dược liệu sinh học biển Việt Nam.. - Các tác giả chân thành cảm ơn sự hỗ trợ từ nhóm nghiên cứu Đa dạng Sinh học và Bảo tồn, Viện CNSH&MT, Trường Đại học Nha Trang và đề tài Bảo tồn nguồn gen đã tài trợ kinh phí và hỗ trợ thực hiện nghiên cứu này.. - Định danh một số loài ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền. - Cấu tạo tuyến nọc độc và mối quan hệ với đặc điểm dinh dưỡng của ba loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum tại vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam