Nghiên cứu điều kiện tồn trữ và hiệu quả của chất bảo vệ sự tồn tại thực khuẩn thể trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện nhà lưới

- DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.159 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỒN TRỮ VÀ HIỆU QUẢ CỦA CHẤT BẢO VỆ SỰ TỒN TẠI THỰC KHUẨN THỂ TRONG QUẢN LÝ BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA.
- Nghiên cứu chất phụ gia phục hồi thực khuẩn thể (TKT) sau đông khô ghi nhận Glucose 10% cho hiệu quả tốt nhất, sau đó là Mannitol (5% và 10%)..
- Khảo sát thời gian tồn trữ ở 3 điều kiện tồn trữ cho thấy dạng bột đông khô trữ nhiệt độ phòng duy trì mật số TKT ổn định đến 5 tháng, trong khi dạng lỏng trữ ở 4 0 C và nhiệt độ phòng mật số TKT giảm mạnh sau 3 và 1 tháng tồn trữ, tuần tự.
- Nghiên cứu chất bảo vệ giúp TKT tồn tại dưới ánh nắng mặt trời, mật số TKT duy trì tương đương nhau ở các nghiệm thức trong 24 giờ sau khi phun trên bề mặt tán lá lúa.
- Nghiệm thức TKT + sữa tách béo giúp duy trì mật số TKT tốt lên đến 5 ngày, ở các nghiệm thức còn lại thì mật số giảm mạnh..
- Tuy nhiên, hiệu quả giảm bệnh không tương quan với mật số TKT trên lá lúa..
- Kết quả này là do hiệu quả giảm bệnh được quyết định dựa vào số lượng TKT tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh trong vài giờ đầu nên việc suy giảm mật số TKT sau 24 giờ không ảnh hưởng đến hiệu quả giảm bệnh.
- Riêng nghiệm thức TKT + bột đậu xanh hoặc đậu nành thể hiện giảm phần trăm diện tích lá bệnh tốt hơn, hiệu quả của hai nghiệm thức này có thể do sự tác động của chất bảo vệ lên tính kháng bệnh của cây bên cạnh tác động của TKT..
- Nghiên cứu điều kiện tồn trữ và hiệu quả của chất bảo vệ sự tồn tại thực khuẩn thể trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
- (2014), nghiên cứu và phân lập TKT ký sinh và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh cháy bìa lá, có hiệu quả ngăn chặn bệnh trong điều kiện nhà lưới với mật số 10 8 pfu/ml.
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu chất phụ gia giúp thể thực khuẩn hồi phục từ dạng bột đông khô.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 7 nghiệm thức bao gồm nghiệm thức đối chứng (bổ sung nước) và các nghiệm thức có bổ sung chất phụ gia Mannitol (5% và 10.
- Nhân nuôi TKT và vi khuẩn: Sử dụng dòng thực khuẩn XaDT60b (Φ60) nhân nuôi trên môi trường King’B 0,8% và vi khuẩn Xoo (dòng XaAG73) được nuôi trên môi trường Wakimoto cải tiến 4 ngày (nguồn vi khuẩn và TKT được nhận từ bộ môn Bảo vệ Thực vật - Trường Đại học Cần Thơ), sau đó mật số ban đầu của TKT trước khi đông khô được xác định bằng phương pháp pha loãng và trải đĩa (Nguyễn Thị Trúc Giang et al., 2014)..
- làm chất bảo vệ thể thực khuẩn trong đông khô (Lương Hữu Tâm, 2013).
- Rút 2 ml huyền phù TKT đã xác định mật số + 2 ml dung dịch đường sucrose 20% (đã lọc qua màng lọc vi khuẩn (0,45 µm)) để được một hỗn hợp TKT trong nồng độ Sucrose 10% vào ống falcon 50 ml, sau đó đặt trong điều kiện -20 0 C trong 24 giờ cho mẫu đã đông đá hoàn toàn, tiến hành đông khô bằng máy đông khô lạnh (Labconco FreeZone 6) ở nhiệt độ -51 0 C và áp suất 0,040 mbar trong 3 ngày.
- Bột TKT sau đông khô được hòa tan trong dung dịch chứa chất phụ gia hồi phục (gồm dung dịch Mannitol (5% và 10.
- Glucose (5% và 10%) và sữa tách béo (skim milk) (10% và 20%) được lọc qua màng lọc vi khuẩn đường kính 0,45 µm) đến đúng thể tích ban đầu là 4 ml, lắc đều, để trong 10 phút (Valdez et al., 1985) và xác định mật số bằng phương pháp pha loãng và trải đĩa..
- Số liệu mật số được chuyển sang log(x) trước khi phân tích..
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 nghiệm thức với 4 lần lặp lại bao gồm: Đông khô - Trữ NĐP (TKT dạng bột đông khô, trữ điều kiện nhiệt độ phòng), dạng lỏng - trữ 4 0 C (huyền phù TKT, trữ ngăn mát tủ lạnh), Dạng lỏng - Trữ NĐP (huyền phù TKT trữ điều kiện nhiệt độ phòng)..
- Tiến hành thí nghiệm: Nghiệm thức bột đông khô trữ nhiệt độ phòng được chuẩn bị như ở mục 2.1 và khi đếm mật số có bổ sung chất phụ gia hồi phục tìm được ở mục 2.1.
- Nghiệm thức dạng lỏng - trữ 4 0 C và trữ NĐP được chuẩn bị bằng cách rút 1 ml TKT có cùng mật số ban đầu cho vào ống eppendorf (mỗi ống là một thời điểm khảo sát và một lần lặp lại) và các ống được trữ tương ứng hai điều kiện..
- Xác định mật số TKT ở các thời điểm tồn trữ 1 ngày tháng sau khi tồn trữ của các dạng tồn trữ khác nhau.
- Số liệu mật số được chuyển sang log(x) trước khi xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0 qua phép thử Duncan..
- 2.3 Nghiên cứu các chất phụ gia giúp duy trì khả năng tồn tại và hiệu quả phòng, trị của TKT trong điều kiện nhà lưới.
- cửa hàng thực phẩm) ở nồng độ 0,5% và mật số TKT trong huyền phù là 10 8 pfu/ml..
- Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 7 nghiệm thức và 4 lần lặp lại gồm: 1.
- TKT + Sữa tách béo (0,5.
- Gieo tổng cộng 42 chậu gồm 28 chậu khảo sát khả năng phòng trị của 7 nghiệm thức trên và 24 chậu để khảo sát khả năng tồn tại của TKT trên tán lá lúa khi kết hợp với chất bảo vệ ở 6 nghiệm thức có xử lý TKT..
- Mật số TKT tồn tại trên tán lá lúa (pfu/g lá) được xác định bằng cách cắt hết lá của 1 cây/chậu/thời điểm cân trọng lượng, cho vào bình tam giác chứa 100 ml nước cất thanh trùng, lắc 20 phút (105 vòng/phút), sau đó xác định mật số TKT trong 1 gram lá, ở các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 3 ngày và 5 ngày sau khi chủng bệnh bằng phương pháp pha loãng và trải đĩa..
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu chất phụ gia giúp TKT phục hồi từ tình trạng đông khô về tình trạng tăng trưởng.
- Qua kết quả Bảng 1, chất phụ gia Glucose 10%.
- cho thấy hiệu quả phục hồi tốt nhất với log mật số TKT (pfu/ml) đạt 9,96 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, sau đó là Mannitol 5% và 10% tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
- Glucose cũng cho kết quả hồi phục tốt trên vi khuẩn Serratia marcescens đông khô với nồng độ 0,05 M (Wasserman và Hopkins,.
- Bảng 1: Hiệu quả các chất phụ gia trong sự hồi phục TKT sau đông khô.
- Nghiệm thức Log mật số TKT (pfu/ml).
- Sữa tách béo 10% 9,38 a.
- Sữa tách béo 20% 9,50 ab.
- Log mật số (pfu/ml) TKT ở các nghiệm thức trước đông khô là 10,08.
- Ngoài ra, TKT ở điều kiện như đông khô khi hồi phục về trạng thái tăng trưởng có thể dẫn đến tổn thương trong cấu trúc, thay đổi tính thẩm thấu hoặc tích lũy chất ức chế làm cho virion bị phá hủy, tổn thương.
- Chất phụ gia có hiệu quả phục hồi thấp nhất là sữa tách béo 10% với log pfu/ml là 9,38 không khác biệt thống kê với Glucose 5%..
- Như vậy, Glucose 10% được chọn làm chất phụ gia hồi phục chế phẩm TKT đông khô..
- Kết quả Bảng 2 cho thấy TKT duy trì mật số tốt nhất trong nghiệm thức đông khô - trữ NĐP qua các thời điểm khảo sát, nghiệm thức dạng lỏng - trữ 4 0 C và dạng lỏng -trữ NĐP TKT giảm nhanh mật số sau 3 và 1 tháng tồn trữ, tuần tự..
- Thời điểm 1 ngày sau khi khảo sát, dạng lỏng - trữ NĐP đã cho thấy giảm mật số với log mật số (pfu/ml) là 9,47 thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 2 nghiệm thức còn lại với log mật số (pfu/ml) là 10,0.
- Trong các thời điểm 1 tháng, 2 tháng sau tồn trữ, đông khô - ĐKP và dạng lỏng - trữ 4 0 C vẫn duy trì mật số tốt tương đương nhau và cao hơn khác biệt ý nghĩa so với dạng lỏng - trữ NĐP..
- Bảng 2: Thời gian tồn trữ TKT trong 3 điều kiện dạng chế phẩm bột đông khô trữ nhiệt độ phòng (NĐP), dạng lỏng - trữ 4 0 C và trữ NĐP.
- Nghiệm thức Log mật số TKT(pfu/ml) sau thời gian tồn trữ.
- 1 ngày 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng Đông khô - trữ NĐP 10,0 b 9,65 b 9,61 b 9,61 c 9,57 c 9,15 b 6,28 b Dạng lỏng - trữ 4 0 C 10,0 b 9,27 b 9,23 b 8,30 b 3,21 b 0,00 a 0,00 a Dạng lỏng - trữ NĐP 9,47 a 5,60 a 3,93 a 3,49 a 0,37 a 0,00 a 0,00 a.
- Ở thời điểm 3 đến 4 tháng tồn trữ, nghiệm thức dạng lỏng- trữ NĐP bắt đầu có sự giảm mật số với log mật số pfu /ml là 8,3 (sau 3 tháng) và 3,21 (sau 4 tháng), thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đông khô- trữ NĐP với log mật số.
- Nghiệm thức dạng lỏng - trữ NĐP tiếp tục giảm mạnh nhất với log mật số (pfu/ml) chỉ còn 3,49 (3 tháng) và 0,37 (4 tháng) (Bảng 2, Hình 1)..
- Hình 1: Mật số TKT ở 3 điều kiện tồn trữ qua 7 thời điểm.
- Thời điểm 5 tháng sau khi tồn trữ, nghiệm thức đông khô - trữ NĐP vẫn còn duy trì mật số TKT tốt với log mật số (pfu/ml) là 9,15, trong khi hai nghiệm thức còn lại không còn ghi nhận TKT tồn tại.
- Vào 6 tháng sau tồn trữ, nghiệm thức đông khô -trữ NĐP bắt đầu giảm mật số với log mật số (pfu/ml) là 6,28.
- Sự giảm mật số TKT trong nghiệm thức đông khô có thể liên quan đến ẩm độ trong sản phẩm đông khô gia tăng so với yêu cầu ẩm độ tối hảo cho tồn trữ sản phẩm đông khô là 4 - 6% (Puapermpoonsiri et al., 2010)..
- Hơn nữa, hiệu quả duy trì mật số TKT tối ưu ở điều kiện đông khô trong nghiên cứu là do kết hợp các chất phụ gia bảo vệ sucrose 10% cộng trong huyền phù trước đông khô và phụ gia hồi phục glucose 10% bổ sung sau khi đông khô.
- Bên cạnh đó, TKT giảm mật số nhiều nhất trong điều kiện trữ dạng lỏng ở nhiệt độ phòng có thể vì sự nhiễm vi sinh vật khác..
- Như vậy, biện pháp đông khô có thể áp dụng để tồn trữ TKT trong ít nhất 5 tháng không suy giảm mật số..
- 3.3 Kết quả chất phụ gia giúp gia tăng khả năng tồn tại và hiệu quả phòng trị của TKT trên bề mặt tán lá lúa.
- 3.3.1 Kết quả khả năng bảo vệ của chất phụ gia đến sự tồn tại của TKT trên bề mặt tán lá lúa.
- Khi bổ sung các chất phụ gia kết hợp TKT nhằm bảo vệ TKT trên tán lá cho thấy hiệu quả tốt trong khoảng 24 giờ sau khi xử lý.
- Nghiệm thức TKT + Sữa tách béo duy trì mật số vượt trội qua các thời điểm..
- Từ thời điểm bắt đầu phun cho đến 12 giờ sau đó ghi nhận sự gia tăng mật số TKT ở nghiệm thức TKT + Sữa tách béo..
- log mật số TKT (pfu/ml).
- Thời gian tồn trữ Đông khô-Trữ NĐP Dạng lỏng-Trữ 4°C Dạng lỏng-Trữ NĐP.
- Bảng 3: Hiệu quả của các chất bảo vệ sự tồn tại TKT trên tán lá lúa qua các thời điểm.
- Nghiệm thức Log mật số TKT (pfu/gram lá).
- TKT + Sữa tách béo 7,56 7,89 c 6,88 6,27 c 4,32 b.
- Thời điểm 24 giờ sau khi xử lý, sự giảm mật số ở hầu hết các nghiệm thức.
- (2007) xử lý TKT vào lúc 6 giờ sáng thì mật số TKT sau 6 giờ giảm 6 log và giảm hoàn toàn sau 4 giờ tiếp theo, khi sử dụng chất bảo vệ thì con số này chỉ là 1 - 2,7 log.
- Thời điểm 3 ngày, hiệu quả duy trì mật số tốt nhất của sữa tách béo đối với TKT, với log mật số còn lại là 6,27 trong khi các nghiệm thức còn lại thì log mật số TKT giảm mạnh.
- Các nghiệm thức TKT + Bột cà rốt, TKT + Bột bắp và TKT + Bột đậu xanh ghi nhận không còn sự hiện diện TKT trên lá..
- Thời điểm 5 ngày sau xử lý, sữa tách béo vẫn cho thấy tiềm năng nhất trong các chất phụ gia sử dụng với khả năng giúp TKT tồn tại cho 1 khoảng thời gian dài với log MS ghi nhận 4,32, các nghiệm thức còn lại TKT không còn tồn tại.
- Như vậy, sữa tách béo nồng độ 0,5% giúp bảo vệ TKT duy trì mật số trong điều kiện tán lá lúa, kết quả ghi nhận tương tự Balogh et al.
- Kết quả Bảng 4 cho thấy các nghiệm thức đều có mật số TKT ổn định trong thời gian 12 giờ đầu sau xử lý (từ 6 giờ chiều đến 6 giờ sáng).
- Thời điểm 24 giờ sau khi xử lý ghi nhận sự giảm mật số một cách đáng kể ở nghiệm thức đối chứng và chỉ có TKT + sữa tách béo cho thấy mật số TKT vẫn duy trì tương đương và không khác biệt ý nghĩa thống kê so với thời điểm 0 giờ..
- Bảng 4: Mật số TKT theo thời gian ở các nghiệm thức kết hợp với chất bảo vệ Nghiệm thức Log mật số TKT (pfu/gr lá) theo thời gian.
- Sữa tách béo TKT.
- Bên cạnh đó, nghiệm thức đối chứng TKT + nước cất vẫn duy trì khả năng hoạt động của TKT đến 24 giờ.
- Điều này có thể do bột đông khô có chứa (sucrose và glucose) góp phần làm nên hiệu.
- dụng sữa tách béo + sucrose cho hiệu quả bảo vệ tốt dưới tác động của ánh sáng UV..
- 3.3.2 Kết quả quản lý bệnh cháy bìa lá lúa của TKT dạng đông khô có bổ sung chất bảo vệ.
- Nhìn chung các nghiệm thức xử lý TKT đều cho thấy hiệu quả giảm bệnh tốt hơn so với đối chứng không xử lý cho đến thời điểm 15 ngày sau khi chủng bệnh (NSKCB) (Bảng 5).
- Trong đó, nghiệm thức TKT + sữa tách béo và TKT + bột đậu xanh cho thấy hiệu quả giảm phần trăm diện tích.
- Thời điểm 10 NSKCB, các nghiệm thức có TKT đều cho hiệu quả giảm phần trăm diện tích vết bệnh tốt hơn, khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý (ngoại trừ nghiệm thức xử lý với bột cà rốt)..
- Thời điểm 15 NSKCB, tất cả các nghiệm thức xử lý TKT đều thể hiện hiệu quả phòng trị, trong đó nghiệm thức TKT+ bột đậu xanh và bột đậu nành thể hiện hiệu quả cao hơn với phần trăm diện tích lá bị bệnh là 31,4% và 38,6 % thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại và đối chứng không xử lý TKT với diện tích lá bị bệnh là 69,7%..
- Bảng 5: Phần trăm diện tích lá bệnh qua các thời điểm ngày sau khi chủng bệnh Nghiệm thức.
- Thời điểm 20 NSKCB, nghiệm thức TKT + bột đậu xanh vẫn cho thấy phần trăm diện tích vết bệnh thấp nhất, tuy nhiên không khác biệt ý nghĩa thống kê với nghiệm thức TKT + sữa tách béo và cho hiệu quả giảm vết bệnh có ý nghĩa hơn đối chứng, các nghiệm thức còn lại không còn thể hiện hiệu quả giảm bệnh khác biệt so với đối chứng..
- Về diện tích bên dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC), tất cả các nghiệm thức xử lý TKT đều giảm sự phát triển của bệnh, nghiệm thức xử lý phụ gia bột đậu xanh và đậu nành là tốt nhất..
- Kết quả Bảng 4 và 5 cho thấy chưa có sự tương quan giữa mật số TKT được duy trì và hiệu quả giảm bệnh.
- Hầu hết các nghiệm thức có xử lý TKT đều thể hiện hiệu quả giảm bệnh, riêng nghiệm thức bột đậu xanh và nghiệm thức bột đậu nành thể hiện hiệu quả cao hơn mặc dù mật số TKT không còn duy trì sau 5 ngày xử lý.
- Kết quả này là do hiệu quả giảm bệnh được quyết định dựa vào số lượng TKT tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh trong vài giờ đầu nên việc suy giảm mật số TKT sau 24.
- giờ không ảnh hưởng đến hiệu quả giảm bệnh..
- Riêng nghiệm thức TKT + bột đậu xanh hoặc đậu nành thể hiện giảm phần trăm diện tích lá bệnh tốt hơn, hiệu quả của hai nghiệm thức này có thể do sự tác động của chất bảo vệ lên tính kháng bệnh của cây bên cạnh tác động của TKT.
- Như vậy, sữa tách béo giúp duy trì mật số TKT trên bề mặt lá lúa.
- Glucose 10% cho hiệu quả hồi phục mật số TKT tốt nhất đối với bột TKT sau đông khô..
- Phương pháp tồn trữ dạng đông khô có thể duy trì mật số TKT ổn định ít nhất 5 tháng tồn trữ ở nhiệt độ phòng, trong khi dạng lỏng trữ 4 o C và nhiệt độ phòng có mật số TKT giảm mạnh sau 3 và 1 tháng sau khi tồn trữ..
- Chất phụ gia sữa tách béo (0,5%) cho hiệu quả duy trì mật số TKT tốt trên bề mặt lá lúa ít nhất 5 ngày trong điều kiện nhà lưới..
- Các chất phụ gia bổ sung vào chế phẩm TKT đông khô đều giúp tăng hiệu quả giảm bệnh (ngoại trừ bột cà rốt).
- Trong đó, đậu xanh, đậu nành và sữa tách béo cho hiệu quả giảm bệnh tốt..
- Kiểm tra hiệu quả giảm bệnh của TKT kết hợp với sữa tách béo bằng biện pháp phun ngừa 1, 3 và 5 ngày trước khi lây bệnh so với đối chứng phun TKT không có kết hợp sữa tách béo..
- Phân lập thực khuẩn thể và đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv