Nghiên cứu gắn kết collagen da cá tra lên bề mặt hydroxyapatite từ xương cá tra

- NGHIÊN CỨU GẮN KẾT COLLAGEN DA CÁ TRA LÊN BỀ MẶT HYDROXYAPATITE TỪ XƯƠNG CÁ TRA.
- Collagen, gắn kết bề mặt, hydroxyapatite, vật liệu y sinh, xương cá tra.
- Nghiên cứu được tiến hành nhằm gắn kết collagen trích ly từ da cá tra (Pangasiidae) lên bề mặt hydroxyapatite (HA) tổng hợp từ xương cá tra làm tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực y sinh.
- Sau khi trích ly, collagen được gắn kết lên bề mặt HA thông qua cầu nối glutaraldehyde..
- Các hạt HA trước tiên gắn kết với 3 – amino propyl triethoxysilane (APTES) tạo nhóm chức amine trên bề mặt.
- Glutaraldehyde là cầu nối gắn kết HA và collagen thông qua phản ứng giữa nhóm chức amine và aldehyde.
- Các yếu tố ảnh đến sự gắn kết như nồng độ collagen, pH dung dịch phản ứng, thời gian và nhiệt độ của phản ứng được tiến hành khảo sát.
- Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ collagen 1 mg/mL, dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH 3, thời gian phản ứng 3 giờ và nhiệt độ phản ứng 37C là điều kiện thích hợp để tiến hành gắn kết.
- Ngoài ra, kết quả chụp SEM cho thấy rằng các hạt HA được chế tạo có kích thước khoảng 1.000 nm và bị phủ một lớp collagen sau khi gắn kết..
- HA là một loại khoáng vô cơ nên có nhiệt độ nóng chảy rất cao và bề mặt khá trơ nên việc tạo hình và ứng dụng chúng là một thử thách đối với các nhà nghiên cứu.
- HA có thể dùng để chế tạo bioceramic và tiến hành ở nhiệt độ rất cao (1.300–.
- Do bề mặt của HA khá trơ nên sự liên kết giữa HA và polymer rất kém dẫn đến không làm tăng cơ tính của polymer thậm chí còn làm giảm khi đưa HA vào nền polymer..
- Chính vì thế, bề mặt HA cần được hoạt hóa hay gắn kết một số nhóm chức nhằm tăng cường khả năng liên kết của chúng với polymer.
- polymer tự nhiên được xem như hợp chất tiềm năng có thể kết hợp lên bề mặt HA nhằm làm tăng khả năng liên kết với polymer và đồng thời làm tăng cường tương thích sinh học so với các thành phần riêng lẽ từ đó làm tăng tính ứng dụng của HA (Yoshimura &.
- Sự gắn kết giữa HA và collagen được thực hiện qua một số phương pháp như tạo mầm tinh thể HA trên sợi collagen (Traub, Arad, &.
- Tuy nhiên, phương pháp tạo mầm tinh thể và đồng kết tủa không thể vừa gắn kết với collagen và vừa cho HA có độ tinh khiết cao.
- Vì thế, phương pháp liên kết ngang đã được sử dụng và đây là phương pháp sử dụng để gắn kết các phân tử như protein hay các hoạt chất lên bề mặt các vật liệu trơ như nano-Fe 2 O 3 ứng dụng trong dẫn truyền thuốc (Chen et al., 2012)..
- Tương tự, Fe 2 O 3 , bề mặt của HA tương đối trơ về mặt hóa học đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học chẳng hạn collagen vì thế không thể gắn kết trực tiếp collagen lên bề mặt HA.
- Do đó để gắn kết collagen lên bề mặt HA, nghiên cứu tiến hành theo các bước được mô tả như Hình 1.
- Bước đầu, bề mặt HA được phản ứng gắn kết APTES, tạo sản phẩm HA-APTES mang nhóm chức amine trên bề mặt..
- Tiếp theo, phân tử glutaraldehyde (C 5 H 8 O 2 ) mang hai nhóm chức CHO ở hai đầu, có nhiệm vụ là cầu liên kết phân tử collagen lên bề mặt HA-APTES thông qua phản ứng giữa các nhóm CHO và amin..
- Sự gắn kết của APTES lên bề mặt của HA và collagen lên bề mặt của HA-APTES được đánh giá bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại FT-IR và hình thái bề mặt của HA trước và sau khi gắn kết được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)..
- Sơ đồ mô tả gắn kết collagen lên bề mặt HA.
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.
- Mẫu xương sau đó được xử lý trong dung dịch NaOH 0.1 M trong 24 giờ để loại béo, protein trên xương.
- Bột xương cá (BXC) phản ứng với dung dịch H 3 PO 4 60 mM với tỉ lệ 1/10 (g/mL), nhiệt độ phản ứng 90℃, pH 11 (NH 3.
- Hỗn hợp sau đó được đưa về nhiệt độ phòng và giữ ổn định 24 giờ, lọc và sấy khô ở nhiệt độ 100℃.
- Mẫu được tiếp tục nung ở nhiệt độ 1000℃.
- Giai đoạn xử lý sơ bộ: mẫu da cá tra nguyên liệu sau khi thu mua từ nhà máy được rửa sạch với nước cất, cắt nhỏ kích thước khoảng 2 cm  2 cm và xử lý trong dung dịch NaOH 0,1 M với tỉ lệ da cá/.
- Dung dịch NaOH được thay mỗi 2 giờ nhằm tăng khả năng loại khoáng và béo.
- Sau khi xử lí sơ bộ, mẫu sẽ được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5 cm  0,5 cm và trích ly trong dung dịch HCl pH 2 chứa 0,1% pepsin với tỉ lệ da cá/ dd HCl = 1:40 g/mL, thời gian 48 giờ và tốc độ khuấy 300 vòng/phút.
- Sau khi lọc bỏ bã bằng màng vải, dung dịch được kết tủa bằng NaCl 1 M và lọc ở 10C thu lấy phần kết tủa.
- Để loại bỏ NaCl, kết tủa được hòa tan bằng dung dịch HCl pH 2 với tỉ lệ 1:20 g/mL, cho vào ống thẩm tách và tiến hành thẩm tách với nước cất trong 24 giờ, tốc độ 400 vòng/phút..
- Sau 24 giờ thẩm tách sẽ thu được dung dịch collagen.
- Trong đó, lưu ý các giai đoạn xử lý và trích ly phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp 4℃ nhằm tránh sự biến tính của nguyên liệu..
- Gắn kết collagen lên bề mặt hydroxyapatite.
- Collagen được gắn kết lên bề mặt HA theo phương pháp hai giai đoạn (Sionkowska &.
- Giai đoạn i, HA nồng độ 1/25 (g/mL) trong ethanol tinh khiết được đánh siêu âm 5 phút và huyền phù sau đó được đặt trong bể đều nhiệt 70°C và khuấy tốc độ 300 v/p.
- Dung dịch huyền phù HA phản ứng với APTES ở nồng độ 0,2 M, hàm lượng nước 0,75%, thời gian 12 giờ, ở nhiệt độ 70°C.
- Giai đoạn (ii) gắn collagen, HA-APTES được phân tán vào dung dịch phosphate buffer saline (PBS) tỉ lệ 1:25 (g/mL) và phản ứng với glutaraldehyde (GA) ở nồng độ 0,25 M, thời gian 1 giờ, ở nhiệt độ 30°C.
- Hỗn hợp được lọc rửa 3 lần với PBS để loại bỏ phần GA còn thừa và sấy khoảng 1 giờ thu được hạt HA-APTES-GA.
- Để gắn kết collagen, hạt HA-APTES-GA sau đó được phân tán vào trong dung dịch collagen được hòa tan trong acetic acid, khuấy đều với tốc độ 300 rpm.
- Collagen sẽ phản ứng gắn kết lên bề mặt HA thông cầu nối GA tạo thành HA-collagen (Hình 1).
- Các yếu tố ảnh được đến sự gắn kết được khảo sát gồm nồng độ collagen thay đổi từ 0,25-1 mg/mL, thời gian phản ứng (30-120 phút), pH acetic acid (2- 4), nhiệt độ phản ứng (4-37.
- Phương pháp phân tích 2.5.1.
- Hiệu quả gắn kết được đánh giá thông qua sự xuất hiện các nhóm chức trên HA, HA-APTES và HA-collagen được xác định bằng phổ hồng ngoại (FTIR, Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer, United States) với bước sóng từ.
- 4000–400 cm –1 , độ phân giải 4 cm –1 .
- Các peak đặc trưng và cường độ peak được so sánh đánh giá hiệu quả gắn kết của APTES, GA và collagen với HA..
- Da cá sau khi xử lí sơ bộ và trích ly trong dung dịch HCl pH 2 chứa 0,1 % pepsin với tỉ lệ 1:40 g/mL, thời gian 48 giờ và tốc độ khuấy 300 vòng/phút theo quy trình đã được đề cập.
- Kết quả phân tích (Hình 3) cho thấy mẫu phổ hồng ngoại của mẫu collagen tồn tại các peak đặc trưng tại bước sóng hấp thu và 1370 cm –1 tương ứng với các dao động của amine A, amine B, amine bậc I, II, III (Singh et al., 2011)..
- Gắn kết APTES lên bề mặt của.
- APTES (3 – amino propyl triethoxysilane) là tác nhân hoạt hóa bề mặt cho nhiều vật liệu khác nhau như TiO 2 , SiO 2 và Fe 3 O 4 (Chen et al., 2012.
- Trong nghiên cứu này, HA được gắn kết bằng APTES theo phương pháp như đã được trình bày phần thực nghiệm nhằm tạo gốc amine gắn kết collaegn (Hình 1).
- Trong đó HA nồng độ 1/25 (g/mL) trong ethanol tinh khiết phản ứng với APTES ở nồng độ 0,2 M, hàm lượng nước 0,75%, thời gian 12 giờ, ở nhiệt độ 70°C nhằm thu được HA-APTES.
- Kết quả phân tích phổ phân tích hồng ngoại (Hình 4) cho thấy rằng mẫu HA ban đầu được đặc trưng bởi peak hấp phụ ở 3570 cm -1 tương ứng cho liên kết OH và peak hấp thụ và 571 cm –1 tương ứng cho 4 peak hấp phụ đặc trưng.
- Khi mẫu HA được gắn kết phân tử APTES thì phổ FTIR xuất hiện các peak đặc trưng của APTES với các peak hấp phụ tại 3400 cm -1 và 1550 cm –1 tương ứng hấp phụ stretching và bending của nhóm NH 2 , cùng với peak hấp phụ tại 2929 cm -1 và 1450 cm -1 tương ứng hấp phụ stretching và bending của CH 2 .
- Ngoài ra, sự xuất hiện peak hấp phụ tại bước sóng 1410 cm –1 và 471 cm –1 tương ứng là đặc trưng cho dao động bending CH 2 -Si và stretching của liên kết Si-O-Si là liên kết mới được hình thành trong quá trình gắn kết giữa HA và APTES từ phản ứng polymer hóa (Chang &.
- Vì thế APTES đã gắn thành công lên bề mặt HA bằng sự xuất hiện các peak đặc trưng ở 3400 cm –1 , 2929 cm –1 , 1550 cm –1 , 1450 cm –1 , 1410 cm –1 và 471 cm –1 tương ứng cho các liên kết của các nhóm NH 2 , CH 2 , CH 2 -Si và Si-O-Si..
- HA HA-APTES.
- Phổ FTIR của mẫu HA và HA-APTES.
- Điều kiện tạo mẫu: HA ethanol 1/25 (g/mL), APTES 0,2 M, hàm lượng nước 0,75%, 12 giờ phản ứng và nhiệt độ 70°C.
- Ảnh hưởng của nồng độ collagen đến khả năng gắn kết lên bề mặt HA Để gắn kết collagen, HA-APTES được phân tán vào dung dịch phosphate buffer saline (PBS) tỉ lệ 1:25 (g/mL) và phản ứng với glutaraldehyde (GA) ở nồng độ 0,25 M, thời gian 1 giờ, ở nhiệt độ 30°C..
- Hỗn hợp được lọc rửa 3 lần với PBS để loại bỏ phần GA còn thừa và sấy khoảng 1 giờ thu được hạt HA- APTES-GA.
- Các hạt này tiếp tục được sử dụng gắn kết với collagen để tạo thành HA-collagen thông qua cầu nối aldehyde của GA.
- Các thí nghiệm được tiến hành ở các nồng độ collagen thay đổi từ 0,25 – 1 mg/mL để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ collagen đến quá trình gắn kết.
- Yếu tố cố định: thời gian phản ứng 60 phút, dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH=3, thời gian gắn kết 1 giờ, nhiệt độ phản ứng 30C.
- Kết quả phân tích FT-IR mẫu sau khi gắn kết.
- (Hình 5) cho thấy bên cạnh sự hiện diện các peak đặc trưng của HA-APTES còn có sự xuất hiện của các peak tại bước sóng 1628 cm -1 , 1550 cm -1 và 1370 cm -1 là các peak đặc trưng của amine I, amine II, amine III và peak ở 1750 cm -1 đặc trưng cho nhóm chức C=O của GA (Barth &.
- Qua đó có thể nói rằng đã gắn kết thành công cho collagen gắn vào bề mặt phân tử HA.
- Ngoài ra, phổ FTIR (Hình 5) cũng cho thấy rằng nồng độ collagen càng cao, quá trình gắn kết diễn ra tốt hơn..
- Khi nồng độ collagen tăng lên thì cường độ peak của các nhóm amine có xu hướng tăng có nghĩa là khả năng gắn kết tốt hơn vì nồng độ collagen tăng lên thúc đẩy quá trình gắn kết diễn ra nhanh chóng, động học phản ứng tăng lên (Azami, Rabiee, &.
- Kết quả phân tích trên cho thấy rằng nồng độ collagen ở 1 mg/mL cho kết quả gắn kết tốt nhất..
- Phổ FTIR của các mẫu HA gắn kết với collagen ở các nồng độ khác nhau.
- Các yếu tố cố định: HA-APTES/dd PBS = 1/25 (g/mL), thời gian phản ứng gắn kết 60 phút.
- dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH 3, nhiệt độ 30  C.
- Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gắn kết collagen với HA.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng gắn kết thí nghiệm được tiến hành ở các khoảng thời gian khác nhau thay đổi từ 1–5 giờ.
- Trong đó, nồng độ collagen 1 mg/mL, dung dịch acetic acid pH 3, nhiệt độ phản ứng 30C sẽ được cố định.
- Kết quả.
- phân tích FTIR mẫu sau khi gắn kết cho thấy rằng khi thời gian phản ứng tăng lên từ 1–3 giờ thì cường độ peak ở 1628 cm –1 của nhóm amine I tăng lên rõ rệt (Hình 6a-c).
- Tuy nhiên khi thời gian tăng lên 4- 5 giờ thì các peak hấp thụ bị nhiễu và trở nên không rõ rệt (Hình 6d-e).
- Điều này cho thấy thời gian 3 giờ là thời gian phù hợp để gắn kết collagen với HA..
- Phổ FTIR của các mẫu HA gắn kết collagen với mốc thời gian khác nhau.
- Các yếu tố cố định: HA-APTES/dd PBS = 1/25 (g/mL), dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH 3, nồng độ collagen 1g/mL, nhiệt độ 30  C..
- Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khả năng gắn kết collagen lên bề mặt HA Phản ứng gắn kết collagen được tiến hành ở các nhiệt độ từ 4–37C trong đó nồng độ collagen 1 mg/mL, thời gian phản ứng 3 giờ, dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH=3.
- Kết quả phân tích FT-IR mẫu sau khi gắn kết cho thấy rằng nhiệt độ càng cao thì quá trình gắn kết các phân tử collagen lên bề mặt hạt HA-APTES-GA diễn ra tốt hơn.
- Tín hiệu của các nhóm amine bậc I và III tăng khi nhiệt độ tăng từ 4 đến 37C.
- Ở 4C tín hiệu 1740 cm -1 của nhóm C=O của GA có cường độ cao nhất và cường độ giảm dần khi nhiệt độ tăng lên 37C.
- tín hiệu nhóm imin (-C=N-) tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 4 đến 37C.
- Điều này là do khi nhiệt độ tăng lên đã làm tăng tốc độ phản ứng của các nhóm amine của phân tử collagen với nhóm –CHO có trong GA..
- Từ phân tích trên cho thấy rằng điều kiện 37C tối ưu cho quá trình gắn kết collagen vào phân tử HA- APTES-GA.
- Kết quả chụp SEM cho thấy rằng so với HA chưa gắn kết (Hình 8a), bề mặt HA gắn kết APTES xuất hiện một lớp mỏng phủ lên bề mặt (Hình 8b) và bề mặt HA khi gắn kết collagen có sự xuất hiện lớp phủ dầy trên bề mặt (Hình 8c) vì thế một lần nữa khẳng định thêm sự gắn kết thành công collagen trên bề mặt HA..
- Phổ FT-IR của các mẫu HA-APTES-GA-Col ở nhiệt độ phản ứng khác nhau a) HA-APTES, b) 4  C, c) 20  C, d) 30  C, e) 37  C.
- Các yếu tố cố định: HA-APTES/dd PBS = 1/25 (g/mL), dung dịch acetic acid hòa tan collagen có pH 3, nồng độ collagen 1g/mL, thời gian phản ứng 3 giờ.
- Nghiên cứu cho thấy rằng có thể trích ly collagen từ da cá tra và gắn kết chúng lên bề mặt hydroxyapatite được điều chế từ xương cá.
- Trong đó điều kiện gắn kết hiệu quả, thời gian phản ứng 3 giờ, dung dịch acetic acid pH 3, nhiệt độ phản ứng 37C và nồng độ collagen 1 mg/mL.
- Kết quả nghiên cứu chứng tỏ rằng có thể hoạt hóa bề mặt hydroxyapatite bằng protein nhằm tăng cường khả năng tương tác với polymer và hoạt tính sinh học của vật liệu từ đó mở ra nhiều hướng ứng dụng trong lĩnh vực y sinh..
- Barth, A., &.
- Sionkowska, A., &.
- Yoshimura, M., &