- NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L Mở đầu Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay ở Việt Nam. - Theo thống kê của Hội Ung thư TP. - Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 bệnh nhân ung thư mắc mới với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày ở nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi ở nữ giới. - Các thuốc ung thư thế hệ mới thường có giá thành cao nên ít bệnh nhân có điều kiện tiếp cận trong khi các thuốc hoá trị liệu cổ điển mặc dù có giá thành hạ nhưng nhiều tác dụng phụ. - Gossypol đã được biết điến với rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư. - Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu. - Gossypol (cũng như một số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT-263, obatoclax (GX15-070) có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis từ đó giúp cho các tế bào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp cho các tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu. - Xuất phát từ thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ” Đề tài được thực hiện với những mục tiêu như sau. - Nghiên cứu độc tính tế bào của các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người.. - Tác dụng chống ung thư Tác dụng chống ung thư của gossypol lần đầu tiên được Tuszinsky và Cossu phát hiện vào năm 1984. - Họ đã tiến hành nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh trưởng của một số dòng tế bào ung thư của người như melanoma (WM9, WM56, WM164), ung thư biểu mô ruột kết (SW407, SW1084, SW1116), dòng erythroleukemia (K562), adenocarcioma (HT3) và trên dòng nguyên bào sợi bình thường của phổi phôi thai (WI38). - Kết quả cho thấy các dòng tế bào melanoma và ung thư biểu mô ruột kết của người nhạy cảm với gossypol nhất, với giá trị IC50 vào khoảng 5 µM. - Trong khi đó các dòng tế bào ung thư khác và dòng nguyên bào sợi bình thường chỉ nhạy cảm với gossypol ở nồng độ trên 20 µM. - Mặc dù gossypol có độc tính tế bào cao trên môi trường nuôi cấy nhưng liều gây chết của nó lại khá cao (LD50 = 2400 mg/kg) trên chuột cống, điều này đã chỉ ra rằng gossypol có độc tính thấp in vivo trên các mô bình thường. - Với độc tính thấp của gossypol trên in vivo cùng với tác dụng đặc hiệu của nó trên một số dòng tế bào ung thư làm cho gossypol rất có tiềm năng làm thuốc điều trị ung thư [53]. - Kể từ đó đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư in vitro của gossypol trên các tế bào ung thư khác nhau như ung thư buồng trứng (IC50 từ 1,5-3,8 µM) [66], ung thư tiền liệt tuyến (IC50 = 10 µM) [68], ung thư vú ( MCF-7, IC µM ung thư dạ con (IC µM) [29], ung thư tuyến thượng thận (IC µM) [29], ung thư phần tuỷ tuyến giáp (IC50 = 18,9 µM) [29], ung thư phổi (IC50 = 0,5 µM trên A549 và 30 µM trên H ung thư ruột (IC50 =17 µM) [64], ung thư máu (IC µM ung thư tụy (IC50 = 3 µM) [7], ung thư da tế bào hình vảy (IC µM) [40] và melanoma (IC50 = 2,4-5 µM) [24]. - Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đăng Quân và cộng sự cho thấy hỗn hợp gossypol racemic phân lập từ hạt bông Gossypium hirsutum trrồng tại Việt Nam có tác dụng ức chế phân bào trên hai dòng tế bào ung thư người là dòng tế bào ung thư cơ RD (Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thư biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma). - Tuy nhiên các tác giả không đưa ra giá trị IC50 của hỗn hợp gossypol racemic trên 2 dòng tế bào được khảo sát [3]. - Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn 2-14 lần so với (+)-gossypol trên các dòng tế bào người [7]. - Đặc biệt hoạt tính chống ung thư của (-)-gossypol cũng đã được so sánh với các thuốc thường dùng để điều trị cho bênh nhân melanoma, ung thư phổi và ung thư máu. - Gossypol cũng có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư kháng với các thuốc chống ung thư đã được sử dụng trên lâm sàng như adriamycin, vinblastine, cisplatine [24]. - Điều đáng lưu ý là (-)-gossypol thể hiện độc tính tế bào một cách chọn lọc được thể hiện bằng liều gây độc của nó trên các dòng tế bào thường cao hơn so với các dòng tế bào ung thư. - Trong nghiên cứu của Oliver và cộng sự, (-)-gossypol ức chế sự sinh trưởng của 10 dòng tế bào ung thư biểu mô hình vảy ở đầu và cổ với IC50 trong khoảng 2.5-10 µM, trong khi đó giá trị này trên nguyên bào sợi bình thường cao gấp 2-10 lần và trên keratinocyte cao gấp 2-3 lần [41].. - Cơ chế gây độc tế bào của gossypol cũng đã được nghiên cứu. - Gossypol đã được biết đến từ những năm 1990 với vai trò là một chất ức chế các enzyme trong tế bào chất và ty thể có liên quan đến quá trình tạo năng lượng của tế bào [58], ức chế các enzyme liên quan đến quá trình tái bản và sửa chữa ADN bao gồm ADN-polymerase α, topoisomerase II và làm cản trở quá trình tổng hợp ADN. - Gossypol có thể điều hoà chu trình tế bào bằng cách điều biến protein điều khiển chu trình tế bào Rb và cyclin D1 và quá trình phosphoryl hoá Rb. - Xử lý tế bào Ramos với gossypol không chỉ gây dừng chu trình tế bào ở pha G0/G1 mà còn làm tăng quá trình apoptosis và ức chế sinh trưởng của tế bào gây ra bởi etoposide (VP-16), doxorubicin hydrocloride (ADM), vincristine (VCR), và paclitaxel (Taxol) [31].. - Gossypol cũng đã được chứng minh là gây ra apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư như các tế bào ung thư ruột kết [67], ung thư máu [17], ung thư tiền liệt tuyến [67], ung thư bàng quang [34]. - Trên dòng tế bào ung thư bàng quang là UM-UC2 (dòng nhạy cảm với thuốc) và UM-UC9 (dòng kháng thuốc), (-)-gossypol làm giảm biểu hiện của các protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2 là Bcl-2, Bcl-xL và Mcl-1, thường được biểu hiện cao trong các dòng tế bào ung thư kháng thuốc và làm tăng biểu hiện của các protein pro-apoptosis trong họ này như Bim, Puma. - (-)-Gosssypol cũng đã được chứng minh là đã đánh bại được sự kháng apoptosis do sự biểu hiện quá mức của Bcl-2 và Bcl-xL trên tế bào ung thư máu Jurkat T. - Tác dụng chống ung thư của (-)-gossypol thông qua sự ức chế protein anti-apoptosis Bcl-xL cùng với sự tăng cường biểu hiện các protein pro-apoptosis là Noxa và Puma [37].. - Đặc biệt, đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng chống ung thư của gossypol trong những năm gần đây. - Một trong những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào năm 1993 sử dụng gossypol theo đường uống với liều 30-70 mg trên 21 bệnh nhân ung thư thượng thận di căn, 30% trong số bệnh nhân này có phản ứng tốt với liệu pháp, trong đó có 3 bệnh nhân giảm trên 50% kích thước khối u sau 6 tuần điều trị [19]. - Một thử nghiệm lâm sàng khác, pha I/II, trên 20 phụ nữ bị mắc ung thư vú di căn với liều 30-50 mg gossypol/ngày theo đường uống cho thấy có 1 bệnh nhân ít đáp ứng với thuốc, 2 bệnh nhân giảm trên 50% các marker ung thư trong huyết thanh. - Thử nghiệm lâm sàng pha I để đánh giá thuốc khi sử dụng phối hợp với cisplatine và etoposite trên bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC) cũng đang được tiến hành [69]. - Một thử nghiệm lâm sàng khác ở pha I/II cũng đang được tiến hành tại Mỹ trên bênh nhân ung thư tiền liệt tuyến. - Hai mươi ba bệnh nhân nam bị mắc ung thư tiền liệt tuyến mới sử dụng hoá trị liệu nhưng có PSA (Prostate-Specific-Antigen) tăng được uống 30 mg (-)-gossypol trong 21 ngày trong chu trình điều trị 28 ngày, sau 20-24 tuần điều trị cho thấy giảm chỉ số PSA trong một số trường hợp. - Tóm lại, gossypol là một hợp chất polyphenol trong tự nhiên có rất nhiều hoạt tính sinh dược học giá trị như tác dụng tránh thai cho nam, chống virus, chống vi sinh vật và động vật nguyên sinh, chống oxi hóa và chống ung thư. - Trong đó, (-)-gossypol đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn hẳn (+)-gossypol như hoạt tính tránh thai, chống HIV và chống ung thư. - Với tác dụng gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tác dụng trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc hóa trị liệu hay xạ trị, (-)-gossypol cũng đã chứng tỏ tác dụng tốt trên lâm sàng nên hứa hẹn sẽ trở thành một thuốc mới góp phần điều trị bệnh ung thư.. - Bệnh ung thư 1.3.1. - Ung thư là gì? Ung thư là quá trình sinh trưởng bất bình thường của các tế bào gây ra bởi những biến đổi phức tạp trong biểu hiện gene dẫn đến làm mất cân bằng giữa quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào và cuối cùng phát triển thành một quần thể tế bào có thể xâm chiếm các mô và di căn đến các vị trí khác, gây bệnh và nếu không điều trị thì sẽ làm chết vật chủ. - Trên quan điểm của lâm sàng, ung thư là một nhóm lớn các bệnh, có lẽ khoảng hai trăm bệnh, đa dạng theo độ tuổi mắc bệnh, tốc độ phát triển, trạng thái biệt hoá của tế bào, triệu trứng, khả năng xâm lấn, di căn, phản ứng với cách điều trị và chẩn đoán. - Trên quan điểm của sinh học phân tử và tế bào, ung thư có thể là một số lượng nhỏ các căn bệnh gây bởi những khiếm khuyết trong chức năng của tế bào ở mức độ phân tử do những biến đổi thông thường trong các gene của tế bào. - Cuối cùng, ung thư là một bệnh với những bất thường trong biểu hiện gene. - Toàn bộ kết quả này làm mất cân bằng giữa quá trình tái bản của tế bào và quá trình chết của tế bào trong quần thể tế bào ung thư dẫn đến sự phát triển của mô khối u [46].. - Tình hình phát triển bệnh ung thư trong nước và trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước phương Tây. - Ở Mỹ và một số nước Châu Âu, ung thư là nguyên nhân gây chết thứ 2 đứng sau bệnh tim mạch. - Riêng ở Mỹ, kể từ năm 1999, số người chết ở độ tuổi dưới 85 vì bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim. - Ở Mỹ, hàng năm có hơn 1,3 triệu ca ung thư mắc mới, trong đó không kể có trên 1 triệu ca hàng năm. - Mức độ nguy hiểm cao nhất trong các bệnh ung thư là ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến. - Hàng năm có hơn 570 nghìn người chết bởi ung thư tại Mỹ [46].. - Tại Việt Nam, ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu. - Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc bệnh ung thư và 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này. - Chỉ tính riêng tại TPHCM, mỗi năm có khoảng ca ung thư mới, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, gan, dạ dày ở nam giới. - ung thư vú, cổ tử cung, phổi ở nữ giới [73]. - Sơ lược về các thuốc điều trị ung thư Cùng với phương pháp điều trị tại chỗ như phẫu thuật và xạ trị phương pháp điều trị toàn thân bằng hoá trị liệu đã góp phần quan trọng vào điều trị và chăm sóc bệnh nhân ung thư. - Các thuốc chống ung thư đang được sử dụng trong hoá trị liệu hiện nay có thể chia thành các nhóm như sau. - Điều trị ung thư theo hướng đích (Targeted cancer therapy): Liệu pháp này sử dụng các loại thuốc ngăn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư bằng cách cản trở các phân tử đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triển khối u. - Các liệu pháp điều trị ung thư theo hướng đích là phương pháp hiệu quả hơn các thuốc điều trị truyền thống và ít gây độc trên các tế bào thường hơn. - Hầu hết các thuốc điều trị ung thư hướng đích hiện nay mới đang được thử nghiệm tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và một số khác đã được FDA đồng ý đưa vào điều trị. - Điều trị ung thư hướng đích có thể sử dụng đơn lẻ, kết hợp với nhau hoặc kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác [2, 46]. - Chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 và tiềm năng trong liệu pháp điều trị ung thư - Họ protein Bcl-2 và con đường apoptosis: Apoptosis là một cơ chế “chết theo chương trình của tế bào” làm cho các sinh vật đa bào có thể điểu khiển được số lượng tế bào trong các mô và loại bỏ các tế bào không cần thiết hay đã bị lão hoá trong quá trình phát triển của cơ quan. - Con đường bên ngoài là hoạt hoá caspase-8 (caspase 10 trên người) xảy ra khi quá trình trimer hoá thụ thể cái chết (death receptor) trên màng tế bào. - Tiềm năng của một số chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 làm thuốc điều trị ung thư Những sai sót trong quá trình apoptosis thường xảy ra trong nhiều loại khối u ác tính trong đó thường do có sự biểu biện quá mức của họ protein Bcl-2, chủ yếu là Bcl-2 và Bcl-xL. - Sự biểu hiện quá mức của các protein này ngăn cản apoptosis thông qua con đường ty thể, góp phần vào quá trình kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của tế bào ung thư. - Do đó, các chất bắt chước domain BH3, có khả năng liên kết với 1 hay nhiều protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2, phát động quá trình apoptosis, rất có tiềm năng trở thành thuốc chống ung thư đặc biệt là để chống lại tính kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của các tế bào ung thư.. - ABT-737 đã được chứng minh là có tác dụng trên nhiều loại tế bào ung thư lympho B, ung thư máu lympho bào mãn tính (CLL) cũng như là dòng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ. - Đặc biệt, nó có tác dụng ức chế hiệu quả các tế bào ung thư phổi trên chuột (mô hình xenografts) với ít tác dụng phụ. - Nó cũng gây chết tế bào ung thư bạch cầu cấp tính (AML) nhưng lại không làm chết tế bào máu bình thường in vitro và ức chế ung thư máu trên mô hình xenografts mà không gây tác dụng phụ. - ABT-737 và A-385358-chất ức chế Bcl-xL đặc hiệu đã được chứng minh là làm cho tế bào ung thư trở lên nhạy hơn với các thuốc hoá trị liệu khác như dexamethasone, vincristine, và L-asparagine [5].. - Obatoclax gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu, ung thứ vú và thậm trí trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc khác như melphalan, ABT-737 hoặc bortezomib. - Đã có nghiên cứu cho thấy rằng obatoclax liên kết với Bcl-w, Bcl-xL và Mcl-1 tái tổ hợp và làm phá vỡ mối tương tác Mcl-1/Bak trong tế bào [35].. - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Nguyên liệu thực vật và các dòng tế bào ung thư. - Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma. - ung thư gan. - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma. - ung thư vú. - Các hóa chất và dung môi dùng cho tổng hợp, tinh chế, đo các loại phổ và thử độc tính tế bào (MTT assay) được mua của hãng Merck hoặc Sigma. - Các thiết bị để nuôi cấy và phân tích độc tính tế bào gồm có: Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C đến -800C. - Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan. - Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. - Hạt bông G. - Phương pháp sắc ký lớp mỏng. - Phương pháp tinh chế gossypol 2.2.3.1. - Kết tinh gossypol dưới dạng G-AA cũng là một phương pháp thường được sử dụng khi phân lập gossypol từ hạt bông và một số sản phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông [16, 39]. - Các mẫu cao này được sử dụng để nghiên cứu quá trình kết tinh.. - Khi nghiên cứu quá trình kết tinh G-AA từ soap stock (một phụ phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông), Michael Dowd và cộng sự cũng nhận thấy kết tinh ở 4ºC hay 50ºC đều không làm tăng hiệu suất của quá trình kết tinh [16]. - Kết quả chúng tôi thu được 0,263 g sản phẩm (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine (hiệu suất 95%, [α]D. - Một số thông số của sản phẩm (-)-gossypol: [α]D. - Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm (+)-gossypol và (-)-gossypol. - Độ tinh khiết của sản phẩm (-)-gossypol mà chúng tôi đã phân tách được đánh giá bằng phương pháp HPLC. - Sản phẩm (+)-gossypol được đem phân tích trên HPLC, với cùng điều kiện như khi phân tích (±)-gosspol và (-)-gossypol. - Sản phẩm (-)-gossypol chúng tôi đã điều chế được có [α]D = -3680 (c 0,311. - Đã tiến hành thử độc tính tế bào bằng phương pháp MTT (MTT assay) của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên 3 dòng tế bào ung thư người. - Nghiên cứu tác dung chống ung thư của (-)-gossypol in vivo, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.. - Nguyễn Bá Đức (2003), Hóa chất điều trị bệnh ung thư. - Nguyễn Đăng Quân, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2002), “Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất gossypol và plumbagin trên dòng tế bào ung thư bằng một số phương pháp thử nghiệm”, Tạp Chí Sinh Học, 24 (4), tr. - 264, pp.192-200