- NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 6-GINGEROL TỪ CỦ GỪNG (Zingiber officinale-rosc). - Củ gừng, 6-gingerol, tách chiết bằng sóng siêu âm. - Ba phương pháp tách chiết 6-gingerol thô từ củ gừng thu mua ở xã Vị Tân, tỉnh Hậu Giang đã được nghiên cứu bao gồm phương pháp ngâm dầm cổ điển (TCG6N), phương pháp khuấy từ không gia nhiệt (TCG6K) và phương pháp siêu âm (TCG6S). - Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp TCG6N cho hàm lượng cao thô nhiều nhất (16,36. - trong khi phương pháp TCG6S cho hàm lượng cao thô tuy hơi thấp hơn (14,18%) nhưng thời gian chiết ngắn hơn (75 phút so với 9 ngày của phương pháp TCG6N). - Sắc ký cột cao ethyl acetate sử dụng hệ dung môi giải ly hexane:ethyl acetate = 3:2 thu được sản phẩm 6-gingerol thô (hiệu suất đạt 37,37%) với hàm lượng 6-gingerol tinh khiết đạt 75,73% (xác định bằng phương pháp GC-MS). - Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy mẫu 6-gingerol thô không có hoạt tính kháng virus (PEDV) và virus cúm H1N1 nhưng có hoạt tính kháng ung thư vú (MCF-7) yếu cũng như kháng Staphylococcus areus yếu.. - Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của củ gừng, trong đó hợp chất 6-gingerol là một hoạt chất trong củ gừng (Nguyễn Thị Hà Duyên, 2011) đã được nghiên cứu và công bố có những hoạt tính sinh học đáng quý như:. - kháng oxy hóa, kháng viêm, chống buồn nôn, nổi bật là hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư, đặc biệt là với tế bào ung thư ruột (Jeong CH et al., 2009), mô vú (Lee H et al., 2008), buồng trứng (Rhode et al., 2007), tụy (Park et al., 2006. - Vì vậy, việc nghiên cứu quy trình tách chiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học của 6- gingerol thô từ củ gừng, đặc biệt là hoạt tính kháng cúm type A và coronavirus sẽ là bước mở đầu cho những nghiên cứu sâu hơn và rộng hơn về khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh của hoạt chất này, góp phần đảm bảo nguồn cung ứng dược liệu trong nước, giảm nhập ngoại.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu. - 2.2.1 Tách chiết cao methanol thô chứa 6- gingerol từ củ gừng bằng phương pháp ngâm dầm cổ điển (TCG6N). - Dịch methanol thu được đem lọc, ly tâm, gạn bỏ kết tủa, cô quay đuổi dung môi, thu được cao methanol thô chứa 6-gingerol. - Tổng lượng cao methanol thô thu được sau 3. - 2.2.2 Tách chiết cao methanol thô chứa 6- gingerol từ củ gừng bằng phương pháp khuấy từ không gia nhiệt (TCG6K). - Quá trình được lặp lại 3 lần thu được tổng lượng cao methanol thô là 3,292 g, đạt hiệu suất 10,97%.. - 2.2.3 Tách chiết cao methanol thô chứa 6-gingerol từ củ gừng bằng phương pháp siêu âm (TCG6S). - 15% ngâm với 300 mL methanol và tiến hành tách chiết với sự hỗ trợ của máy phát sóng siêu âm trong 60 phút. - Dịch methanol thu được đem lọc, ly tâm, gạn bỏ kết tủa, cô đuổi dung môi thu được cao methanol thô chứa 6-gingerol. - Quá trình chiết được thực hiện 3 lần thu được tổng lượng cao methanol thô là 3,369 g, đạt hiệu suất 11,23%.. - 2.2.4 Tách chiết sản phẩm 6-gingerol thô Mẫu cao methanol thô (5 g) được hòa với 20 mL methanol và 50 mL nước cất. - Cô đuổi dung môi dưới áp suất kém thu được cao ethyl acetate thô. - Cao ethyl acetate thô dùng để nạp cột sắc ký silica gel, sử dụng hệ dung môi giải ly hexane:ethyl acetate = 6:4 thu được sản phẩm 6-gingerol thô.. - 2.2.5 Phân tích thành phần sản phẩm 6- gingerol thô. - Thành phần hóa học của sản phẩm 6-gingerol thô tách chiết được từ củ gừng được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ trên máy GC-MS của hãng Thermo Scientific tại Bộ môn Hóa, Khoa Khoa học Tự nhiên. - 2.2.6 Xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn được kiểm định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế, thực hiện ở Phòng Kiểm nghiệm Hóa Lý-Vi Sinh, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.. - 2.2.7 Xác định độc tính trên tế bào ung thư Thử nghiệm độc tính trên tế bào của 6-gingerol thô thực hiện trên dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) bằng phương pháp MTT. - 2.2.8 Thử nghiệm hoạt tính kháng virus cúm H1N1 và virus Porcine Epidemic Diarrhea (PEDV). - Thử nghiệm hoạt tính kháng virus cúm H1N1 và virus Porcine Epidemic Diarrhea (PEDV) được tiến hành bằng phương pháp Cytopathic effect (CPE), thực hiện ở phòng thí nghiệm Dược liệu, Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Tách chiết cao methanol thô chứa 6- gingerol từ củ gừng. - Ba phương pháp tách chiết cao methanol thô chứa 6-gingerol từ củ gừng ở quy mô phòng thí nghiệm được tiến hành khảo sát bao gồm: tách chiết bằng phương pháp ngâm dầm cổ điển (TCG6N). - tách chiết bằng phương pháp khuấy từ. - 3.1.1 Phương pháp ngâm dầm cổ điển (TCG6N). - Đối với phương pháp TCG6N, từ 100 g bột nguyên liệu ban đầu, sau ba lần chiết mỗi lần với 500 mL methanol trong 3 ngày thu được tổng lượng cao methanol thô là 16,364 g, đạt hiệu suất 16,36%. - Đáng lưu ý là tuy phương pháp TCG6K cho hàm lượng cao thô thấp hơn so với phương pháp TCG6S (14,18%) nhưng thời gian chiết ngắn hơn (60 phút so với 75 phút).. - 3.1.2 Phương pháp khuấy từ không gia nhiệt (TCG6K). - Đề tài tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu của của phương pháp (TCG6K). - Từ kết quả thực nghiệm cho thấy khối lượng cao methanol thu được tăng theo thể tích methanol sử dụng và thời gian khuấy trộn hỗn hợp. - Tuy nhiên, khi tăng thể tích dung môi từ 150 đến 250 mL và sau khoảng thời gian 60 phút thì lượng cao methanol thô thu được thay đổi không đáng kể, vì vậy để vừa tiết kiệm được lượng dung môi và thời gian đồng thời vừa thu được khối lượng cao thô nhiều nhất thì tỉ lệ giữa nguyên liệu/dung môi = 1/15 (g/mL) và thời gian 60 phút được lựa chọn cho việc trích ly.. - Hình 1: Ảnh hưởng của thể tích methanol đến lượng cao thô. - Hình 2: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng cao thô Tóm lại, điều kiện tốt nhất để tách chiết cao. - methanol thô bằng phương pháp khuấy từ không gia nhiệt như sau: khối lượng nguyên liệu sử dụng là 10 g, tỉ lệ lượng dung môi methanol và nguyên liệu là 1:15 (g/mL) và thời gian chiết là 60 phút.. - Trong điều kiện này, khối lượng cao thu được tương ứng là 1,382 g, đạt hiệu suất 13,82%.. - 3.1.3 Phương pháp siêu âm (TCG6S). - Trên cơ sở kết quả tách chiết cao methanol thô bằng phương pháp cổ điển và khuấy từ không gia nhiệt, đề tài tiến hành xây dựng quy trình chiết cao methanol thô với sự hỗ trợ của sóng siêu âm. - Kết quả được trình bày trong Hình 3 và Hình 4.. - Hình 3: Ảnh hưởng của thể tích methanol đến lượng cao thô Từ kết quả thực nghiệm trên cho thấy khối. - lượng cao methanol thu được tăng theo thể tích methanol sử dụng. - Do sự khác biệt về khối lượng cao methanol không nhiều khi tăng thể tích dung. - môi từ 150 đến 250 mL nên tỉ lệ giữa nguyên liệu/dung môi = 1/15 (g/mL) được lựa chọn là tỉ lệ tốt nhất để vừa thu được khối lượng cao thô nhiều vừa tiết kiệm dung môi.. - Hình 4: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng cao thô Từ các kết quả thực nghiệm trên cho thấy sau. - 75 phút thì lượng cao methanol thô thu được thay đổi không đáng kể, vì vậy thời gian tốt nhất cho việc trích ly được chọn là 75 phút.. - Tóm lại, điều kiện tốt nhất để tách chiết cao methanol thô bằng phương pháp siêu âm như sau:. - khối lượng nguyên liệu sử dụng là 10 g, lượng dung môi methanol là 150 mL và thời gian chiết là 75 phút. - Trong điều kiện này, khối lượng cao thu được tương ứng là 1,418 g, đạt hiệu suất 14,18%.. - Bảng 1: Hàm lượng 6-gingerol trong cao methanol thô. - STT Phương pháp Cao methanol thô. - 3.2 Tách chiết sản phẩm 6-gingerol thô Từ cao methanol thô, sau khi loại béo bằng hexane tiến hành chiết với ethyl acetate thu được cao ethyl acetate tương ứng. - Độ tinh khiết của sản phẩm 6-gingerol thô được tiến hành phân tích bằng phương pháp GC-MS.. - Kết quả được tóm tắt trong Bảng 2. - Từ đây cho thấy sản phẩm 6-gingerol thô có độ tinh khiết đạt 75,73%.. - Bảng 2: Thành phần các hợp chất trong 6-gingerol thô. - 3.3 Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của 6-gingerol thô. - Sản phẩm 6-gingerol thô được tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm độc tính đối với tế bào ung thư vú (MCF-7). - hoạt tính kháng virus cúm PEDV và virus cúm H1N1 và hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn.. - 3.3.1 Thử nghiệm độc tính với tế bào ung thư Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng có mật độ 5000 tế bào/giếng, với môi trường nuôi cấy là DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) có nồng độ glucose cao, 10%. - Tế bào được xử lý với 6-gingerol thô pha loãng bằng dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau và đảm bảo nồng độ cuối của DMSO (Dimethylsulfoxide) trong môi. - trường nuôi cấy không vượt quá 0,05% (v/v) để tránh gây độc do dung môi. - Enzyme của những tế bào sống sót sẽ chuyển hóa MTT thành formazan không bị hòa tan trong môi trường nuôi cấy. - Thành phần phần trăm của tế bào sống sót biểu thị độc tính của 6-gingerol thô. - Khi độc tính càng cao thì số lượng tế bào sống sót càng thấp. - Kết quả được trình bày trong Hình 5.. - Từ biểu đồ Hình 3 cho thấy 6-gingerol thô có hoạt tính yếu với tế bào ung thư, EC . - 3.3.2 Hoạt tính kháng virus cúm H1N1 và PEDV Hoạt tính kháng virus H1N1. - Dòng tế bào MDCK được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng có mật độ 5000 tế bào/giếng, với môi trường nuôi cấy là DMEM có nồng độ glucose cao, 10%. - Sau 24 giờ nuôi cấy, virus H1N1 được truyền nhiễm vào tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có nồng độ glucose cao chứa 1% P/S và trypsin, 0,5%. - Sau 2 giờ nhiễm virus tế bào được rửa với PBS 1X (Phosphate- buffered saline) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM có nồng độ glucose cao chứa 10 µg/ml trypsin. - Tế bào được xử lý với đối chứng âm là DMSO, đối chứng dương là ribavirin và các hợp chất thử nghiệm đã được hòa tan bằng dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau, đảm bảo nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy không vượt quá 0,05% (v/v) để tránh gây độc dung môi. - Emzyme của những tế bào sống sót sẽ chuyển hóa MTT thành formazan không bị hòa tan trong môi trường nuôi cấy. - Thành phần phần trăm của tế bào sống sót được biểu thị cho hoạt tính kháng virus của các chất. - Khi các chất có hoạt tính kháng virus càng cao thì số lượng tế bào sống sót càng nhiều. - Thành phần phần trăm hoạt tính được sát định bằng cách so sánh độ hấp thụ ở giếng thử nghiệm với độ hấp thu ở giếng đối chứng. - Kết quả cho thấy 6-gingerol thô không có hoạt tính này.. - Hoạt tính kháng virus Porcine Epidemic Diarrhea (PEDV). - Dòng tế bào Vero được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng có mật độ 5000 tế bào/ giếng, với môi trường nuôi cấy là DMEM có nồng độ glucose cao, 10%. - Sau 24 giờ nuôi cấy, virus PEDV được truyền nhiễm vào tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có nồng độ glucose cao. - Sau 2 giờ nhiễm virus tế bào được rửa với PBS 1X và được nuôi cấy trong môi trường DMEM có nồng độ glucose cao. - Tế bào được xử lý với đối chứng âm là DMSO, đối chứng dương là azauridine và các hợp chất thử nghiệm đã được hòa tan bằng dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau, đảm bảo nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy không vượt quá 0,05%. - (v/v) để tránh gây độc dung môi. - Thành phần phần trăm của tế bào sống sót được biểu thị cho hoạt tính kháng virus của các chất, khi các chất có hoạt tính kháng virus càng cao thì số lượng tế bào sống sót càng nhiều. - Thành phần phần trăm hoạt tính được xác định bằng cách so sánh độ hấp thụ ở giếng thử nghiệm với độ hấp thu ở giếng đối chứng. - Kết quả đánh giá cho thấy sản phẩm 6-gingerol thô không có hoạt tính đối với virus Porcine Epidemic Diarrhea (PEDV).. - 3.3.3 Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn được kiểm định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế. - Kết quả được trình bày trong Bảng 3. - Bảng 3: Giá trị đường kính vòng vô khuẩn của 6-gingerol thô. - cho thấy hai phương pháp khuấy từ không gia nhiệt (TCG6K) và phương pháp siêu âm (TCG6S) tuy cho hàm lượng cao methanol thô có hơi thấp hơn so với phương pháp ngâm dầm cổ điển (TCG6N) nhưng thời gian tách chiết ngắn hơn nhiều (60 và 70 phút so với 9 ngày). - Hàm lượng 6-gingerol thô là như nhau trong cả ba phương pháp khảo sát. - Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy sản phẩm 6-gingerol thô không có hoạt tính kháng virus H1N1 và PEDV và kháng nấm nhưng có hoạt tính kháng yếu đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) đồng thời cho dấu hiệu kháng được vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus.. - Oh Won Keun (Khoa Dược – Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã hỗ trợ khảo sát thử nghiệm hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư, kháng (PEDV) và virus H1N1 của 6-gingerol thô.