- TRONG BÁNH DẦU ĐẬU NÀNH. - Đề tài nghiên cứu sử dụng enzim papain thô trích ly trực tiếp từ mủ đu đủ để thủy phân bánh dầu đậu nành tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi.. - Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu cho enzim papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là nhiệt độ 55 o C và pH 7,0. - Bố trí tương tác 2 nhân tố nhiệt độ và pH cũng cho kết quả tương tự như riêng từng nhân tố. - Với tỉ lệ enzim:cơ chất là 0,75:100 (w:w), hoạt tính đặc hiệu của enzim là 91,12 TU/mg, thời gian thủy phân là 24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất 11,8%. - Điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy thành phần protein trong bánh dầu đậu nành có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 14,4-80 kDa. - Sau 24 giờ hầu hết các protein có trọng lượng phân tử cao đều bị thủy phân và thành phần trong dịch thủy phân nhận được ngoài axit amin là các polypeptid có trọng lượng phân tử từ 14,4-25,0 kDa.. - Từ khóa: papain, bánh dầu đậu nành, dịch thủy phân protein. - Một trong các enzim có nguồn gốc thực vật là papain được ly trích từ mủ trái đu đủ và được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong công nghiệp hóa chất, bào chế dược phẩm …Với điều kiện khí hậu ở Việt Nam thì ở đâu cũng trồng được đu đủ, hàm lượng mủ trong trái còn xanh rất nhiều, vì vậy việc thu nhận papain rất dễ dàng, papain với hoạt tính cao có thể thủy phân protein. - Bên cạnh đó, trên thị trường thức ăn gia súc, bánh dầu đậu nành đang là nguồn đạm rất được quan tâm do có hàm lượng protein cao khoảng 41- 50%, nhưng do trong thành phần bánh dầu đậu nành ngoài protein còn có các yếu tố kháng dinh dưỡng như chất ức chế hoạt động enzim trypsin, các chất saponin v.v…, làm ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa cho gia súc nhất là các động vật non.. - Vì vậy, nhằm làm gia tăng giá trị dinh dưỡng của bánh dầu đậu nành với nguồn enzim papain sẵn có, chúng tôi thực hiện đề tài:". - Nghiên cứu sử dụng enzim papain thô từ nhựa đu đủ để thủy phân protein trong bánh dầu đậu nành ". - với mục tiêu của đề tài : Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của enzim papain trong quá trình thủy phân bánh dầu đậu nành để xác định hiệu suất thủy phân tối ưu. - Bánh dầu đậu nành ly trích (Ấn Độ) mua tại các cửa hàng thức ăn gia súc, nghiền mịn bằng máy nghiền mẫu Retch (Đức), trữ ở -20 o C. - Trước khi thủy phân bột bánh dầu đậu nành được xử lý sơ bộ bằng cách thêm nước với tỉ lệ 1:3. - Thí nghiệm được bố trí theo thể thức 1 hoặc 2 nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của enzim papain lên quá trình thủy phân bánh dầu đậu nành bao gồm pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân. - Ở mỗi nghiệm thức có 1 đối chứng (enzim bất hoạt) và mẫu có enzim được lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.. - TN1: Khảo sát pH tối ưu của enzim papain từ 4-10. - TN2: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của enzim papain ở 8 mức độ: 4 o C, 25 o C, 35 o C, 45 o C, 55 o C, 65 o C, 75 o C, 85 o C.. - TN3: Khảo sát tương tác giữa nhiệt độ và pH lên quá trình thủy phân với tổng số nghiệm thức là 9, nhân tố nhiệt độ thủy phân có 3 mức độ 25 o C, 55 o C, 8 5 o C. - TN4: Khảo sát tương tác giữa nồng độ cơ chất và thời gian lên quá trình thủy phân với tổng nghiệm thức là 20 với thời gian thủy phân 4 mức độ: 1 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và nồng độ cơ chất có 5 mức độ: 1gam, 2 gam, 4 gam, 6. - TN5: Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzim vào các giai đoạn khác nhau lên hiệu suất thủy phân.. - Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả dịch thủy phân ở các thí nghiệm là xác định hàm lượng đạm amin sinh ra ở mỗi nghiệm thức. - Riêng thí nghiệm cuối cùng đế đánh giá khả năng thủy phân với các điều kiện tối ưu đã chọn ở các thí nghịêm trước, ngoài chỉ tiêu trên còn kiểm tra phần trăm thu hồi vật chất khô và trọng lượng phân tử của sản phẩm thủy phân bằng điện di trên gel SDS-PAGE.. - Khảo sát hàm lượng đạm tổng số trong nguyên liệu bánh dầu đậu nành ly trích bằng phương pháp Kjeldahl. - Hoạt tính của enzim papain tại thời điểm khảo sát bằng phương pháp Kunitz cải tiến, hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford (1976). - Hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA (Nielsen, 2001).. - Phần trăm thu hồi vật chất khô được tính là tỉ lệ % vật chất khô (%DM) của dịch thủy phân chia cho % vật chất khô của dịch thủy phân chưa ly tâm nhân 100. - Từ phương trình đường chuẩn ta có thể tính được trọng lượng phân tử của sản phẩm thủy phân.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần nguyên liệu. - Hàm lượng đạm tổng số chiếm 7,4% tương ứng với hàm lượng protein trong bánh dầu đậu nành khoảng 44,03%. - Đây là nguồn nguyên liêu chứa lượng đạm khá cao, kết quả tương đối phù hợp với các kết quả của Kellems và Church (1998), nên có thể xem đây là nguồn đạm phong phú để tiến hành thủy phân.. - Hàm lượng protein của dịch chiết mủ đu đủ tương đối cao (2,565mg/ml), do đây là enzim thô nên còn lẫn những protein tạp khác. - 3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân protein bánh dầu đậu nành với papain. - 3.2.1 Kết quả khảo sát pH tối ưu của enzim. - Do phản ứng thủy phân diễn ra trong thời gian khá dài (trên 24 giờ) để có được hiệu suất thủy phân cao, nên việc khảo sát độ bền nhiệt hay độ bền pH của enzim là điều cần quan tâm. - Các kết quả nhận được như sau:. - Bảng 1: Hàm lượng đạm amin sinh ra trong quá trình thủy phân và hiệu suất thủy phân ở các pH khác nhau. - Hàm lượng đạm amin (mgN/g Hiệu suất thủy phân (N%) 7,88 a 5,72 a 13,24 b 15,67 b 7,60 a 8,31 a 8,75 a. - Tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. - Kết quả phân tích thống kê cho thấy với cơ chất bánh dầu đậu nành papain hoạt động mạnh trong khoảng pH 6-7, thể hiện hoạt tính thủy phân mạnh nhất ở pH 7,0, tương ứng với hàm lượng đạm amin và hiệu suất thủy phân nhận được là 11,60 mgN/g và 15,67. - Như vậy có thể xem pH tối thích cho hoạt động của papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là 7,0 tương tự như trên casein.. - 3.2.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của enzim. - Với tỉ lệ enzim : cơ chất, pH tối thích đã chọn từ thí nghiệm trên, trong thí nghiệm này phản ứng thủy phân được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau. - Kết quả nhận được ở Bảng 2. - Bảng 2: Hàm lượng đạm amin sinh ra và hiệu suất thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. - Nhiệt độ o C . - Hàm lượng đạm amin (mgN/g). - Hiệu suất thủy. - Kết quả thống kê cho thấy độ bền nhiệt của enzim papain khá rộng trong khoảng 45 o C - 65 o C, hiệu suất thủy phân cao và khác biệt không ý nghĩa giữa các nhiệt độ này. - Ở các nhiệt độ thấp 4 o C và 25 o C enzim hoạt động yếu hơn so với ở 75 o C và 85 o C. - Dựa theo số liệu trong bảng 2 có thể chọn nhiệt độ 55 o C là nhiệt độ tối thích cho hoạt động thủy phân của papain trên protein bánh dầu đậu nành.. - 3.2.3 Kết quả khảo sát sự tương tác giữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy phân protein bánh dầu đậu nành. - Sau khi đã khảo sát riêng từng nhân tố pH và nhiệt độ, và chọn ra được pH=7 và nhiệt độ 55 o C là các điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân Khảo sát sự tương tác giữa hai nhân tố này cho kết quả theo phương trình ở hình 1với hệ số tương quan R . - Hình 1 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hiệu suất thủy phân. - Kết quả trên đồ thị hình 1 cho thấy ở nhiệt độ 55 o C và pH trong khoảng từ 6 đến 7 cho hiệu suất thủy phân cao nhất. - Kết quả này phù hợp với thí nghiệm bố trí riêng cho từng nhân tố. - Như vậy có thể khẳng định các điều kiện pH 7,0 và nhiệt độ 55 o C là điều kiện tối thích cho hoạt động thủy phân của enzim papain lên protein trong bánh dầu đậu nành. - Theo phân tích thống kê thì hai nhân tố nhiệt độ và pH tương tác ở mức ý nghĩa là 1%.. - 3.2.4 Kết quả khảo sát tương tác giữa cơ chất và thời gian lên quá trình thủy phân Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và thời gian lên phản ứng thủy phân đươc tiến hành ở các giá trị pH và nhiệt độ tối ưu chọn ra từ các thí nghiệm trên. - Kết quả nhận được như sau. - Kết quả ở bảng 3 cho thấy cùng 1 lượng enzim nếu tăng cơ chất thì hoạt tính thủy phân tăng, điều này thể hiện qua lượng đạm amin sinh ra tăng (hình 2), ở 3 hàm lượng cơ chất thấp: 1, 2 và 4 gam hoạt tính thủy phân thấp và hầu nhự không tăng nữa sau 12 giờ, ở hàm lượng cơ chất 6 gam, sau 12 giờ đầu phản ứng thủy phân mạnh, lượng đạm amin sinh ra nhiều, sau đó vẫn còn tăng nhưng không cao lắm.. - Ở hàm lượng cơ chất là 8 gam. - Điều này có thể là do khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ thủy phân của enzim sẽ tăng và đạt cực đại sau 12 giờ khi enzim bảo hoà cơ chất. - Trong điều kiện thừa cơ chất và thời gian thủy phân kéo dài các enzim được giải phóng sẽ lại tiếp tục tham gia phản ứng thủy phân, do vậy tốc độ thủy phân vẫn tăng.. - Tuy nhiên, theo tính toán về mặt hiệu suất, kết quả trên hình 3, thì khi tăng hàm lượng cơ chất, hiệu suất thủy phân lại giảm, do ta tính hiệu suất dựa trên lượng đạm amin sinh ra so với tổng lượng cơ chất sử dụng.. - Về mặt kinh tế, dựa trên kết quả hiệu suất thủy phân ta có thể chọn điều kiện tỉ lệ nồng độ cơ chất:enzim là 100:0,75 (w:w) để tiến hành phản ứng thủy phân.. - Bảng 3: Ảnh hưởng chất cơ chất và thời gian lên hàm lượng đạm amin sinh ra và hiệu suất thủy phân. - Thời gian (giờ). - Cơ chất (g). - Hàm lượng đạm amin (mgN). - Hiệu suất thủy phân (N%). - Lượng đạm amin (mgN). - Hình 2: Biểu đồ ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất và thời gian thủy phân lên hàm lượng đạm amin. - Hình 3: Biểu đồ ảnh hưởng của lượng cơ chất và thời gian lên hiệu suất thủy phân. - 3.2.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzim vào các thời điểm khác nhau lên hiệu suất thủy phân. - Theo một số kết quả nghiên cứu (Whitaker John R. - et al., 2003) thì hoạt tính của enzim có thể giảm dần theo thời gian trong quá trình thủy phân có thể do sự tự phân giải enzim, hay enzim bị biến tính và mất hoạt tính, sự giảm pH hoặc sản phẩm sinh. - enzim thành ba phần bằng nhau, bổ sung vào từng giai đoạn 6 giờ, 21 giờ, 30 giờ, và theo dõi quá trình thủy phân đến 47 giờ. - Kết quả nhận được như sau:. - Kết quả nhận được ở bảng 4 cho thấy không có sự khác biệt giữa việc cho enzim vào cùng một lúc hay bổ sung enzim vào từng thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân. - Hiệu suất thủy phân tính theo phần trăm thu hồi vật chất khô sau 6 gam không tăng nữa cho thấy phản ứng thủy phân đã kết thúc, tuy nhiên hàm lượng đạm amin vẫn còn tăng tuy không cao do các peptid hòa tan vẫn được tiếp tục thủy phân thành các acid amin nếu kéo dài thời gian, nhưng tổng phần trăm chất khô hòa tan nhìn chung là không đổi.. - Giếng 2 : Dung dịch protein bánh dầu đậu nành chưa thủy phân;. - Giếng 3,4,5,6 : dịch thủy phân tương ứng sau giờ.. - Hình 4: Phổ điện di sự ảnh hưởng của việc bổ sung cùng 1 lượng enzim vào các giai đoạn khác nhau lên kết quả chạy điện di. - Phổ diện điện di cho ta thấy các protein trong bột đậu nành ly trích có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 14,4-70 kDa. - Kết quả điện di cũng cho thấy sau 6 giờ phản ứng thủy phân cũng diễn ra chậm hơn, ngoài băng protein có trọng lượng phân tử trên 22 kDa bị thủy phân hoàn toàn các băng còn lại sau 47giờ vẫn chưa được thủy phân triệt để. - Trong thí nghiệm đối chứng sau 6 giờ ta thấy hầu hết các băng protein có trong lượng phân tử từ 31 kDa trở lên đều bị thủy phân (giếng 3a).. - Sau 21giờ các băng protein có trọng lượng phân tử cao hơn 22 kDa đều bị thủy phân cho các polypeptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 22 kDa, 20 kDa với hàm lượng ít dần qua màu của các băng protein nhạt dần trên gel (giếng 5a, 6a), polypeptid có trọng lượng phân tử nhỏ nhất là 14,4 kDa chiếm hàm lượng cao nhất.. - Qua quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân của enzim papain lên cơ chất bánh dầu đậu nành chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:. - Papain thô hoạt động mạnh trên cơ chất bánh dầu đậu nành trích ly ở điều kiện tối ưu là nhiệt độ 55 o C và pH 7,0. - Với tỉ lệ enzim:cơ chất là 0,75:100(w:w), hoạt tính đặc hiệu của enzim là 91,12 TU/mg, thời gian thủy phân là 24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất.. - Sản phẩm thủy phân nhận được ngoài các axit amin còn có các polypeptit có trọng lượng phân tử từ 14,4-25,0 kDa. - Để thủy phân triệt để hơn các polypeptit còn lại cần khảo sát thêm các điều kiện như xử lý mẫu trong điều kiện acid hay kiềm hay bổ sung các enzim exoproteaz.. - Có thể kết hợp sử dụng kỹ thuật điện di và sắc ký để theo dõi quá trình thủy phân và nhận diện các peptit có khối lượng phân tử thấp.