- Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu. - Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của 04 hoạt chất là các lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans là acid meso-dihydroguairetic, macelignan, fragransin A2, nectandrin B trên mô hình tế bào 2D, spheroid và in vivo. - Kết quả như sau: Trong 04 hoạt chất thì acid meso-dihydroguairetic có hoạt tính kháng u mạnh nhất khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. - Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). - Ở mô hình spheroid, acid meso-dihydroguairetic có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và gây tan khối cầu spheroid MCF7. - Hoạt chất phân lập. - Chống ung thư. - Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng gia tăng. - Năm 2000, ở Việt Nam tỷ lệ mắc chung của bệnh ung thư ở nam giới là dân, ở nữ giới là dân, thì đến năm 2010 tỷ lệ này ở nam giới tăng đến dân và ở nữ giới tăng đến dân. - Trong đó các loại bệnh ung thư có tỷ lệ mắc mới tăng rõ rệt là ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư thực quản, ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới và ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư đại tràng và ung thư tuyến giáp ở nữ giới. - Mỗi năm Việt Nam có khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư. - Bệnh ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng, không loại trừ một ai trong xã hội. - Việc nghiên cứu tìm ra các chất có khả năng điều trị căn bệnh ung thư, cũng như ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung. - Đến nay, đã có nhiều hoạt chất chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên đã được khám phá ra và đem vào sử dụng trên lâm sàng. - Các hoạt chất điển hình là paclitaxel (taxol), vinblastin và vincristin, camptothecin, adriamycin…. - Đã có nhiều hoạt chất được tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư cũng như ngăn chặn sự phát triển của khối u được tìm thấy như: đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Đu đủ (Papayaceae) [24], gấc (Momordica cochinchinensis Streng) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [1], trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [9. - Do đó, chắc chắn trong thiên nhiên vẫn còn tiềm ẩn các hoạt chất có tác dụng chống ung thư đang chờ con người khám phá.. - Các lignan (tức là các phenylpropanoids) là thành phần chủ yếu có tác dụng sinh học của hạt nhục đậu khấu, gồm các chất chính fragransin A2, nectandrin B, macelignan, meso-dihydroguaiaretic acid. - Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học các lignan phân lập từ hạt có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm giảm đau, có tác dụng bảo vệ gan, giảm cholesterol trong máu, chống xơ vữa động mạch, kháng khuẩn.. - Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt và các lignan phân lập từ hạt ở Việt Nam và thế giới mới có rất ít [27].. - Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans” với các mục đích chính như sau:. - Thử hoạt tính chống ung thư của các hoạt chất lignan phân lập được trên mô hình nuôi cấy tế bào 2D.. - Tạo mô hình và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của lignan có tác dụng chống ung thư mạnh nhất (trong các lignan đã thử nghiệm 2D) trên mô hình 3D và in vivo.. - Ung thư không phải chỉ là một loại bệnh mà là khoảng trên 200 loại bệnh khác nhau [34]. - Mỗi loại có nguyên nhân riêng của nó, nhưng đều có nguồn gốc chung từ việc tế bào bị đột biến gen [34]. - Năm 1953, lần đầu tiên tế bào ung thư được quan sát dưới kính hiển vi điện tử. - Những thành tựu nghiên cứu ở mô hình tế bào cho đến nay là cơ sở chắc chắn cho nhận định của giáo sư Arnold Graffi “vấn đề của ung thư thực chất là vấn đề của tế bào học”. - Vì vậy muốn điều trị ung thư phải hiểu được cơ sở tế bào học của nó [8, 34]. - Các đặc điểm nổi bật chung của tế bào ung thư là tế bào bị đột biến gen, có khả năng sự tăng sinh vô hạn, không kiểm soát được, có khả năng xâm lấn và phát triển ở các cơ quan, tổ chức khác của cơ thể (sự di căn), có khả năng tăng sinh mạch máu [13, 34].. - Bệnh ung thư bắt đầu từ khi có một tế bào bắt đầu vượt qua sự kiểm soát của cơ thể, bị đột biến gen, phát triển không ngừng và hình thành một đám tế bào có chung đặc điểm là phát triển vô kiểm soát, xâm lấn và chèn ép các mô xung quanh. - Có rất nhiều nguyên nhân làm chuyển dạng tế bào lành thành tế bào ung thư, bao gồm: các tác nhân vật lý (chủ yếu là tia bức xạ ion hóa), các tác nhân hóa học, các virus, một số bệnh viêm mạn tính, nhiễm trùng lâu ngày, rối loạn nội tiết, rối loạn hoạt động enzyme và nhiều vấn đề dinh dưỡng liên quan. - Ngoài ra, ung thư còn có thể do yếu tố di truyền bẩm sinh. - Quá trình hình thành khối u từ tế bào ung thư phải trải qua nhiều giai đoạn. - Thời gian từ tế bào ung thư khởi đầu đến khi xuất hiện một u có thể nhận biết gọi là thời kì tiềm ẩn (ở người có thể kéo dài từ 10 đến 20 năm) [8, 34]. - Sau khi phát triển thành khối u, các tế bào ung thư tiếp tục tăng sinh hỗn loạn, tự mất đi các thụ thể để nhận biết giới hạn với các tế bào bên cạnh, sản xuất ồ ạt cytokin và enzyme proteaza để phá hủy màng đệm lót và môi trường ngoại bào xung quanh. - Do đó, các tế bào ung thư liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục sinh sôi, nảy nở, tăng sinh số lượng. - Nói cách khác, di căn là một hay nhiều tế bào ung thư tăng trưởng ở một khoảng cách nào đấy cách nơi phát sinh tiên phát của khối u. - Thông thường do hậu quả của di căn mà ung thư gây ra là xấu, có khả năng gây tử vong... - Thuốc chữa ung thư có nguồn gốc thực vật gồm một số alkaloid, glycozid hoặc các dẫn chất bán tổng hợp của chúng. - Từ dừa cạn đã chiết được các alkaloid chữa ung thư là vinblastin, vincristin, cũng như các bán tổng hợp từ vinblastin là vinorelbin và eldisin. - Nước chiết từ tỏi có tác dụng chống lại ung thư miệng của chuột hamster khi gây ung thư miệng chuột. - Dầu tỏi và dầu hành có tác dụng chống lại khối u ở da chuột nhắt trắng. - Cây này ở nước ta chưa thấy nghiên cứu tác dụng chữa ung thư nhưng ở Mỹ người ta đã chiết được từ cây Podophyllum peltatum L. - cùng họ Berberidaceae chất podophyllotoxin có tác dụng chữa ung thư.. - Từ thông đỏ đã chiết xuất ra chất 10-deacetylbaccatin II, rồi chuyển hóa ra thành taxol có tác dụng chữa ung thư.. - Đu đủ tên khoa học là Carica papaya L, họ đu đủ papayaceae, qua nghiên cứu đều cho thấy có tác dụng chữa ung thư. - Phương pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt chất trong mô hình in vitro. - a, Nạp tế bào. - 8000 tế bào trong 180 µl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùy thuộc từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37 0 C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chất.. - Tế bào được ủ với các chất theo 5 nồng độ 30μM -10μM -3μM -1μM – 0,3μM trong 48h. - Protein tổng số của tế bào sau khi cố định bằng TCA 50% được nhuộm trong 10 phút bằng dung dịch SRB 4% với lượng 100µl/giếng ở nhiệt độ phòng. - Dựa vào giá trị mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế bào theo công thức sau:. - VH: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi dùng để pha hoạt chất. - T : là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với hoạt chất Nếu : A = 50% thì có nghĩa là thuốc đã ức chế và làm chết 50% tế bào.. - Nồng độ của hoạt chất khi A đạt giá trị 50% gọi là liều gây ức chế 50% sự phát triển của tế bào, kí hiệu là IC50.. - Phương pháp thử tác dụng của hoạt chất trên spheroid MCF7 Phương pháp tạo spheroid MCF7. - Bước 2: Chuẩn bị tế bào. - Hoạt hóa tế bào từ Nitơ lỏng:. - Rã đông tế bào lưu giữ trong Nitơ lỏng (-196 0 C). - Phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp (khoảng 7ml MT) trong ống falcon 15ml.. - Thu tế bào lắng, phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp có bổ sung 20% FBS, ủ trong tủ ấm 37 0 C, 5% CO 2 . - Nuôi tế bào đến khi tế bào bám mặt đĩa nuôi cấy khoảng 75-90% thì tiến hành thu tế bào.. - Thu tế bào: sử dụng trypsin để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. - Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma.. - Nhỏ 20µl tế bào (nồng độ 5000TB/20µl) lên nắp đĩa. - Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid trên spheroid MCF7. - Sau khi hạ giọt spheroid, để spheroid phát triển ổn định, sau khoảng 5-7 ngày tiến hành tra mẫu hoạt chất với 5 nồng độ khác nhau µM. - Bố trí thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1 trên mô hình spheroid MCF7 3.8(µM) Taxol (µg/ml) A M VH B M VH C M VH D M VH . - Tiến hành theo dõi sự phát triển của khối spheroid dưới tác dụng của thuốc ở các nồng độ khác nhau. - Phương pháp gây u rắn và thử tác dụng chống ung thư của hoạt chất 1 trên chuột Gây u. - Dùng sơranh, kim 18G tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào Sarcoma180 (tương đương 10 6 tế bào) vào dưới da vùng ngực (lệch về phía bên phải chuột) để tạo u rắn trên chuột.. - 01 Lô Đối chứng ung thư - viết tắt là ĐCUT: chuột được cấy truyền TBUT.. - 01 Lô Đối chứng ung thư uống dung môi - viết tắt là ĐCDM: chuột được cấy truyền TBUT, uống dung môi là dầu gấc.. - 01 Lô Đối chứng ung thư uống 6-MP – viết tắt UT+6-MP: chuột được cấy truyền TBUT, uống 6-MP pha trong nước cất.. - 03 lô đối chứng ung thư uống hoạt chất 1 - viết tắt là UT+1 (1g/kg). - UT+1 (0,2g/kg): chuột được cấy truyền TBUT, uống hoạt chất 1 pha trong dung môi dầu gấc với nồng độ hoạt chất lần lượt là 1g. - 0,2g hoạt chất trên 1kg thể trọng chuột.. - Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của 04 hoạt chất là các lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans là acid meso-dihydroguairetic, macelignan, fragransin A2, nectandrin B trên mô hình tế bào 2D, spheroid và in vivo chúng tôi thu được các kết quả như sau: Trong 04 hoạt chất thì acid meso-dihydroguairetic có hoạt tính kháng u mạnh nhất khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. - Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM).. - Từ những nghiên cứu in vitro và in vivo đã tiến hành trên 4 hoạt chất meso- Dihydroguaireic acid. - meso-dihydroguairetic acid có hoạt tính kháng u khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC 50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 (IC µM). - không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK với tỷ số tăng sinh đạt 87,76% so với đối chứng khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM).. - meso-dihydroguairetic acid có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và gây tan khối cầu spheroid của dòng tế bào MCF7. - Chất thử còn có tác dụng làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử, kéo dài nhất là liều 1g/kg thể trọng. - Những kết quả nghiên cứu trên có thể kết luận hoạt chất meso-dihydroguairetic acid (1) có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư in vitro và in vivo. - Tuy nhiên cơ chế tác dụng của hoạt chất này vẫn chưa được biết rõ. - Hy vọng những kết quả này sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và định hướng phát triển của hoạt chất 1 trong tương lai.. - Lê Xuân Hải (2009), Đánh giá độc tính và tác dụng kích thích miễn dịch, chống gốc tự do của cao thuốc thảo dược VID, Luận án tiến sĩ.. - Hiệp hội chống ung thư UICC (1999), Ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội.. - Bùi Văn Lệ, “Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật và đường saccarose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9 (6), tr59.. - Nguyễn Thị Quỳ (1993), Gây tạo mô hình u báng thực nghiệm và thử tác dụng phòng chống ung thư của một số hoạt chất tự nhiên và tổng hợp, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.. - Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Kamenarka.Z, Bankova.V, Popov.S, Zvetkova.E, Lê Mai Hương (2011), “Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn Alcoloid từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crium latifolium. - Trần Công Yên (1990), Tế bào ung thư - một mục tiêu tấn công chủ yếu của Sinh – Y học hiện đại, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tài liệu đánh máy lưu hành nội bộ.