- DOI:10.22144/ctu.jsi.2019.033 NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP NANOSILICA - CURCUMIN - BROMELAIN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH LÊN DÒNG NGUYÊN BÀO SỢI TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT Lại Đình Biên. - Ứng dụng công nghệ nano vào việc điều chế phức hợp silica – curcumin – bromelain tạo ra hạt phức hợp có kích thước nano tăng khả năng tiếp xúc, hấp thụ của cơ thể mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học từng chất, cũng như hỗ trợ cho quá trình điều trị các vết thương hở, vết bỏng, sẹo lồi, lõm nhanh hơn. - Đề tài đã thử nghiệm hạt nanosilica – curcumin – bromelain kích thước 10 – 100 nm thành công trên dòng tế bào nguyên bào sợi thu nhận từ chuột nhắt trắng và tối ưu nồng độ hoạt chất ở 7,5%. - Bên cạnh đó, ứng dụng phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain trong điều trị vết bỏng cấp độ II trên mô hình chuột nhắt trắng đã cho kết quả liền sẹo và mọc lông sau 18 ngày, nhanh hơn so với không điều trị 7 ngày.. - Nghiên cứu tạo phức hợp nanosilica - curcumin - bromelain và đánh giá hoạt tính lên dòng nguyên bào sợi trên mô hình động vật.. - Bromelain và curcumin khi kết hợp sẽ tạo hiệu quả cộng hưởng trong điều trị làm lành vết thương. - Curcumin và bromelain tan trong nước rất kém – làm giảm khả năng hấp thu và bám dính trên tế bào nên gây nhiều hạn chế cho việc sử dụng rộng rãi trong lâm sàn và nghiên cứu. - Ứng dụng công nghệ nano vào việc điều chế phức hợp silica-curcumin-bromelain tạo ra hạt phức hợp có kích thước nano tăng khả năng tiếp xúc, hấp thụ của cơ thể mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học từng chất, cũng như hỗ trợ cho quá trình điều trị các vết thương hở, vết bỏng, sẹo lồi, lõm nhanh hơn.. - 2.1.1 Chuẩn bị phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain. - 2.2 Phương pháp. - 2.2.1 Phương pháp tạo phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain. - Phức hơp nanosilica – curcumin – bromelain được kiểm tra chất lượng và kích thước bằng phương pháp chụp TEM, hoạt tính của bromelain cũng được kiểm tra bằng phương pháp đông tụ sữa.. - Tách tế bào đơn bằng trypsin ấm. - Sau khi thực hiện quy trình, tiếp tục cho 1 ml môi trường vào trộn đều, cho tế bào rời ra tạo huyền phù tế bào. - Quan sát và xác định mật độ tế bào/ml.. - Nuôi cấy sơ cấp dòng tế bào nguyên bào sợi. - Chuyển lượng tế bào huyền phù ban đầu với lượng môi trường nuôi cấy DMEM/F12 và 1% antibiotic – antimycotic có bổ sung huyết thanh với nồng độ 15% với mật độ 2x10 4 tế bào/ml. - với các tỷ lệ phối trộn hạt nanosilica – curcumin – bromelain thử nghiệm là 2,5%. - Từ tế bào đã thu nhận và cấy chuyền 2 lần. - Đánh giá hoạt tính của hạt phức hợp ảnh hưởng sự phát triển của nguyên bào sợi trên khả năng tăng sinh và bám dính của tế bào bằng kính hiển vi và phương pháp đếm buồng đếm hồng cầu. - Từ đó so sánh được hoạt tính của phức hợp nanosilica- curcumin- bromelain đối với các mẫu đối chứng khác, cũng như tìm được nồng độ tối ưu để tăng trưởng của tế bào nguyên bào sợi. - Thử nghiệm điều trị. - Bố trí thí nghiệm với nghiệm thức sau: Không sử dụng điều trị. - Sử dụng nanosilica – curcumin – vaseline. - Sử dụng nanosilica – curcumin – bromelain – vaseline. - Thoa mỗi ngày 2 lần (sáng và chiều), quan sát ghi nhận kết quả hằng ngày đến lúc lành vết thương.. - 2.2.5 Kĩ thuật tách tế bào để đếm mật độ Đổ bỏ môi trường cũ trong đĩa nuôi có tế bào.. - Dùng pipet hút 2 ml PBS sạch cho vào giếng nuôi, rửa sạch huyết thanh và tế bào chết. - Hút 2 ml môi trường nuôi cấy vào đĩa tráng đều bề mặt đĩa nuôi có tế bào. - Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm Neubauer. - Lấy 100µl dịch huyền phù tế bào cho vào một eppendorf, bổ sung 900µl thuốc nhuộm. - Đếm tế bào trong 5 ô vuông lớn.. - Mật độ tế bào trong 1ml C = N d 5 10 4 C: số tế bào trong 1ml dịch nuôi. - N: số tế bào đếm trong 5 ô lớn d: nồng độ pha loãng. - 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Tạo hạt phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain từ phương pháp đánh siêu âm. - Dựa trên quy trình 2.1, đã tạo thành công hạt phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain có kích thước từ 10 – 100 nm được chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua như Hình 1. - Hình 1: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của hạt nano silica – curcumin – bromelain 3.2 Thử nghiệm hoạt tính phức hạt. - nanosilica – curcumin – bromelain trên dòng tế bào nguyên bào sợi thu nhận từ chuột nhắt trắng. - Từ mẫu chuột nhắt trắng mang bầu 13 đến 18 ngày tuổi, tiến hành thu nhận tế bào đơn bằng phương pháp tách trypsin ấm. - Lượng tế bào thu được sau tách trypsin đếm trên buồng đếm hồng cầu, tính toán và xử lý thống kê ANOVA với độ tin cậy 95% nhận được kết quả là x 10 4 tế. - Sau hai lần cấy chuyền như Hình 2, tiến hành phân lô thử nghiệm với nồng độ phức hợp 2,5%. - Sau 24h (Hình 2), cho kết quả hầu hết tế bào ở các mẫu thử nghiệm đều bám dính và bắt đầu lan.. - Có sự khác biệt nhiều ở Hình 2E, hình ảnh nguyên bào sợi nuôi cấy trong môi trường khảo sát có chứa 5% bromelain, các tế bào kết tụ và không xuất hiện hình ảnh bám dính. - Với những nghiệm thức còn lại, sự sai khác về mặt hình ảnh chưa đánh giá được. - Sau 72h, trong môi trường chứa 5% bromelain đơn (Hình 3F), tế bào có hiện tượng chết dần tạo rất nhiều huyền phù trong giếng nuôi. - Tất cả tế bào đều co tròn và trôi trong môi trường nuôi cấy. - (2013), bromelain làm giảm đáng kể lượng myofibroblast, điều này có lợi trong việc giảm sẹo vết thương, kết quả hình ảnh nghiệm thức F phù hợp với điều này. - Nghiệm thức A – 2,5%. - phức hợp 3 chất cũng có xuất hiện nhiều huyền phù trong môi trường nuôi cấy. - Tế bào có hiện tượng chết dần. - Tại mốc thời gian này, nghiệm thức C và. - H cho kết quả tế bào tiếp tục phát triển tốt hơn các nghiệm thức còn lại. - Tế bào sáng, lan đều và chia nhánh tăng sinh nhiều. - Ở nghiệm thức H (Hình 3H), tế bào già hóa nhanh hơn so với Hình 5C. - Nghiệm thức D – 10% phức hợp 3 chất những mốc thời gian trước phát triển rất tốt, nhưng đến thời điểm 72h (Hình 3D) tế bào chậm tăng trưởng, có nhiều tế bào yếu, co tròn không bám dính trên bề mặt nuôi cấy.. - Nghiệm thức G – 5% curcumin, hình ảnh cho kết quả tế bào tăng sinh chậm lại, tế bào lan dài nhưng hẹp và yếu. - Có thể xác định nghiệm thức C – 7,5%. - nồng độ phức hợp 3 chất phát triển ổn định. - Bám dính tốt qua các mốc thời gian không có sự suy giảm như nghiệm thức D và không già hóa nhanh như nghiệm thức H. - Đến thời điểm 96h thể hiện rõ sự tối ưu của nồng độ 7,5% hoạt chất so với những nghiệm thức khác.. - Hình 2: Hình ảnh tế bào nguyên bào sợi nuôi cấy trong những môi trường đánh giá khác nhau lúc 24 giờ A;B;C;D: Nồng độ nanosilica- curcumin- bromelain . - E: Nồng độ nano silica – curcumin 5%. - Mật độ tế bào được đếm dưới buồng đếm hồng cầu và tính toán xử lý thống kê ANOVA với độ tin. - Bảng 1: Mật độ tế bào nguyên bào sợi (x10 4 TB/ml) qua các mốc thời gian. - Thời gian Nghiệm thức. - Hình 3: Hình ảnh tế bào nguyên bào sợi nuôi cấy trong những môi trường đánh giá khác nhau lúc 72 giờ A;B;C;D: Nồng độ nanosilica- curcumin- bromelain . - Sau 24h, nghiệm thức F – 5% bromelain, A – 2,5% phức hợp 3 chất, C – 7,5% phức hợp 3 chất, H – không sử dụng hoạt chất có mật độ tế bào cao như nhau. - Mật độ tế bào nghiệm thức B – 5% phức hợp 3 chất, D – 10% phức hợp 3 chất, E – 5% phức hợp hai chất, G – 5% curcumin có mật độ tương đồng nhau và thấp hơn.. - Sau 72h, nghiệm thức F có mật độ tế bào giảm nhiều và khác biệt so với các nghiệm thức còn lại.. - Mật độ của nghiệm thức C, D, E, H cao như nhau cho thấy sự tăng sinh như nhau của các nghiệm thức này sau 72h nuôi cấy thử nghiệm.. - Khi so sánh sự tăng tưởng của nguyên bào sợi trong các môi trường nuôi được bổ sung và điều chỉnh theo từng nồng độ dược liệu, đối chứng cho thấy khi bổ sung với nồng độ 7,5% lượng phức hợp 3 chất nanosilica – curcumin – bromelain thì tế bào phát triển tốt, tăng trưởng ổn định. - Sự trao đổi chất của tế bào được gia tăng lên đáng kể theo thời gian khảo sát được đánh giá bằng cách quan sát hình thái và đếm bằng buồng đếm hồng cầu cho kết quả mật độ của nồng độ tối ưu là cao nhất sau 72h (Bảng 1).. - Sự kết dính, bám dính và lan rộng của tế bào sau khi quan sát dưới kính hiển vi Leica với độ phóng đại 10X thể hiện sự tương thích của hoạt chất cùng sự cộng hưởng của bromelain và curcumin ở nồng độ 7,5%. - curcumin trong nghiên cứu tiền đề thì kết quả nghiên cứu trên đây chứng minh được những tác dụng sinh học của các chất trong phức hợp và sự tối ưu tác dụng khi các chất được kết hợp với nhau ở dạng cực nhỏ 10-100 nm giúp tế bào nguyên bào sợi tăng trưởng và phát triển ổn định. - Là cơ sở phân tích, chứng minh khả năng làm lành vết thương tối ưu của phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain.. - 3.3 Thử nghiệm ảnh hưởng của nanosilica – curcumin – bromelain trong làm lành vết thương ở mô hình động vật. - Sau 21 ngày quan sát và theo dõi mẫu đánh giá in vivo trên chuột bằng cách gây bỏng nóng và điều trị bằng 5 nghiệm thức khác nhau: A: đối chứng âm (không điều trị), B: đối chứng dương (kem nghệ Thorakao), C: đối chứng vaseline, D: hợp chất nano silica – curcumin, E: hợp chất nanosilica- curcumin- bromelain. - Đường kính trung bình vết thương ban đầu khoảng 1,03cm.. - 5 nghiệm thức khác nhau: A: đối chứng âm (không điều trị), B: đối chứng dương (kem nghệ Thorakao), C: đối chứng vaseline, D: hợp chất nano silica – curcumin, E: hợp chất nanosilica- curcumin- bromelain. - Bảng 2: Kích thước trung bình của vết bỏng đánh giá sau 21 ngày điều trị với 5 nghiệm thức (cm) qua các mốc thời gian. - Nghiệm thức Ngày có tác động khác biệt. - 5 nghiệm thức khác nhau: A: đối chứng âm (không điều trị), B: đối chứng dương (kem nghệ Thodakao), C: đối chứng vaseline, D: hợp chất nano silica – curcumin, E: hợp chất nanosilica- curcumin- bromelain. - Hình 5: Biểu đồ đánh giá kích thước (cm) vết thương thay đổi theo các mốc thời gian trong 21 ngày điều trị với 5 nghiệm thức. - Đối chiếu theo chỉ tiêu phân loại cấp độ bỏng, vết bỏng được tiến hành khảo sát cho 5 nghiệm thức nằm ở mức độ bỏng trung bình (bỏng độ II sâu).. - vaseline tác động đến quá trình lành vết thương. - Điều này cho thấy các vật liệu điều trị đều không gây hiện tượng kháng thuốc trên chuột.. - Trong nghiệm thức này, mẫu D và E vẫn tiếp xúc có quá trình lành vết thương khá tốt, E là vượt trội hơn hẳn vì đã tróc hẳn mài và miệng vết bỏng được tái tạo ổn định, không xuất hiện sẹo lồi, sẹo lõm, sẹo phì đại. - Sau 18 ngày điều trị, mẫu E sử dụng hỗn hợp nanosilica- curcumin- bromelain cho thời gian điều trị nhanh nhất, diện tích vết bỏng giảm nhanh, độ kháng khuẩn tốt nhất, không hề xuất hiện hiện tượng kháng thuốc, đặc biệt mẫu E có quá trình liền sẹo tương đối ổn định và nhanh nhất trong 5 mẫu thử nghiệm. - Mẫu D sử dụng nanosilica – curcumin có mức độ lành vết thương cũng như kháng khuẩn tốt, tuy nhiên so với mẫu E thì thời gian và mức độ liền sẹo vẫn còn hạn chế. - Hai mẫu đối chứng B và C đều kháng khuẩn và thúc đẩy quá trình lành vết thương nhưng thời gian hồi phục vẫn không khác nhiều so với mẫu đối chứng âm (không điều trị). - Quá trình tăng sinh quá nhanh của các nguyên bào sợi sinh ra nhiều nguyên bào sợi là nguyên nhân chính gây ra sẹo lồi, sẹo lõm, sẹo phì đại gây mất thẩm mĩ trong quá trình điều trị bỏng, việc sử dụng bromelain bổ sung vào hợp chất dẫn dược hỗ trợ cho quá trình làm lành vết thương và ổn định sự tái tạo của tế bào nguyên bào sợi hạn chế sẹo cho việc điều trị (Roxana, 2007), hơn thế nữa tác dụng cộng hưởng của bromelain và curcumin trong việc xúc tác hoạt tính của curcumin làm tăng khả năng trong quá trình điều trị.. - Kết quả điều trị từ hạt nano hỗn hợp tốt, chứng tỏ các hạt nano phức. - Hạt phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain là sự kết hợp ưu điểm cũng như khắc phục nhược điểm của từng chất curcumin, bromelain và nanosilica.. - Đề tài đã tạo thành công hạt phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain đạt kích thước từ 10 – 100 nm và kiểm tra được hoạt tính bromelain vẫn có tác dụng đông tụ sữa. - Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain với 8 nghiệm thức bao gồm 4 mẫu khảo sát với các nồng độ khác nhau và 4 mẫu đối chứng lên dòng nguyên bào sợi thu nhận từ chuột nhắt trắng. - Qua thực nghiệm, kết luận được ở nồng độ 7,5% hoạt chất là tối ưu cho khả năng tăng sinh và bám dính của tế bào nguyên bào sợi đánh giá qua mật độ đếm trên buồng đếm hồng cầu và hình ảnh dưới kính hiển vi tiêu cự 10X. - Tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của nanosilica – curcumin – bromelain trong làm lành vết thương ở mô hình động vật (chuột nhắt trắng - Mus musculus var. - Bằng phương pháp gây bỏng nhiệt trên 5 lô mẫu tương ứng với 5 nghiệm thức điều trị. - Sau 18 ngày, đánh giá ở mẫu điều trị bằng hạt phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain là có thời gian lành nhanh nhất, miệng vết thương đóng và không để lại sẹo quá rõ. - Đến ngày 21 mẫu được điều trị bằng nanosilica – curcumin – bromelain đã bắt đầu mọc lông tại miệng vết thương cũ và vết sẹo gần như không thấy.