- NGHIÊN CỨU TẠO PROTEIN TÍN HIỆU NANOLUCIFERASE: ỨNG DỤNG TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC NHẬN DIỆN KHÁNG SINH. - Cảm biến sinh học, chloramphenicol,. - erythromycin, hệ thống tổng hợp protein ngoài tế bào, Nanoluciferase,. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm tổng hợp protein tín hiệu nanoluciferase trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro), sử dụng hệ thống phiên mã dịch mã ngoài tế bào (cell-free synthesis) để ứng dụng tạo cảm biến sinh học nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.. - Mạch mã khuôn cho quá trình tổng hợp protein được chuẩn bị bằng cách khuếch đại và tinh sạch đoạn DNA mã hoá cho protein nanoluciferase (NanoLuc). - Kết quả đã xác định protein NanoLuc được tổng hợp thành công thông qua sự hiện diện trên gel SDS page nhuộm CBB với kích thước 21 kDa và có khả năng phát sáng khi tác dụng với cơ chất Furimazine.. - Khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn được xác định thông qua thử nghiệm nhận diện một số kháng sinh đại diện gồm oxytetracycline, chloramphenicol và erythromycin. - Tính đặc hiệu của quá trình nhận diện được xác định. - Mặc dù cần khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein NanoLuc trong điều kiện in vitro nhưng kết quả này cũng tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra cảm biến sinh học có khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.. - Nghiên cứu tạo protein tín hiệu nanoluciferase:. - Ứng dụng tạo cảm biến sinh học nhận diện kháng sinh. - Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như ô nhiễm nguồn nước, kích thích sự phát triển của các loài vi khuẩn kháng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản làm ảnh hưởng tiêu cực đến sức khoẻ người tiêu dùng cũng như chất lượng của sản phẩm xuất khẩu. - Năm 2015, theo kết quả điều tra về tình hình sử dụng kháng sinh trong ao nuôi thuỷ sản nước ngọt ở Đồng bằng sông Cửu Long và Đồng bằng sông Hồng, có 10 loại kháng sinh khác nhau được sử dụng trong đó 3 loại được sử dụng phổ biến nhất là trimethoprim (30,8. - oxytetracycline (30,9%) và sulfomethoxazole (41,5%) (Pham et al., 2015). - Nghiên cứu của Hoa et al. - (2011) cho thấy hàm lượng kháng sinh trong môi trường nước càng cao thì tần số xuất hiện vi khuẩn kháng kháng sinh càng nhiều, ví dụ như hàm lượng sulfamethoxazole được xác định từ µg/l thì tần suất xuất hiện của vi khuẩn kháng sulfamethoxazole từ . - trong khi đó hàm lượng erythromycin được xác định từ µg/l, thì tần suất xuất hiện của vi khuẩn kháng erythromycin thấp hơn, từ . - Hiện nay, việc phát hiện kháng sinh trong môi trường nuôi trồng thuỷ sản cũng như dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản được xác định bằng các phương pháp truyền thống như sắc ký lỏng cao áp (HPLC) hay sắc ký khối phổ (GC-MS) (Phu et al., 2015. - Uchida et al., 2016). - Nhằm phát triển cảm biến sinh học phát hiện một số kháng sinh được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thuỷ sản như nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn như nhóm aminoglycosides, tetracyclines, chloramphenicol và macrolides trong môi trường nước cũng như trong sản phẩm thuỷ sản với chi phí thấp, thời gian phân tích nhanh, quá trình phân tích đơn giản, ít phụ thuộc vào những thiết bị hiện đại như các phương pháp truyền thống, nghiên cứu. - “Tạo protein tín hiệu nanoluciferase (NanoLuc) ứng dụng phát triển cảm biến sinh học nhận diện. - nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn” được thực hiện nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu kế tiếp trong việc phát triển cảm biến sinh học nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.. - Plasmid pET21a-NLuc mang gen mã hoá protein NanoLuc được cung cấp bởi PGS. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu. - 2.2.1 Chuẩn bị DNA khuôn cho quá trình biểu hiện protein NanoLuc trong hệ thống cell-free system. - Nghiên cứu thử nghiệm qui trình PCR sử dụng. - terminator 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ để khuếch đại gen mã hoá protein NanoLuc. - Sản phẩm khuếch đại là đoạn DNA gồm vị trí gắn ribosome (ribosome binding site), gen mã hoá protein NanoLuc hoạt động dưới sự điều khiển của promoter T7 và trình tự của terminator T7. - Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. - Sản phẩm PCR đã tinh sạch được dùng làm mạch mã khuôn cho quá trình biểu hiện protein NanoLuc trong điều kiện in vitro.. - 2.2.2 Phương pháp tổng hợp protein tín hiệu NLuc trong điều kiện in vitro (in vitro transcription translation system – IVTT). - Thử nghiệm tổng hợp protein NanoLuc trong điều kiện in vitro sử dụng PUREfrex 2.0 kit (Genefrontier, Nhật Bản) (Nishikawa and Ueda, 2001). - 0,5 µL dung dịch III và 50 ng DNA khuôn của gen mã hoá protein NanoLuc (sản phẩm PCR tinh sạch). - Đối chứng âm là phản ứng không có chứa DNA khuôn của gen mã hoá protein NanoLuc. - Protein NanoLuc. - tổng hợp được kiểm tra thông qua khả năng phát sáng khi tác dụng với cơ chất Furimazine (Hình 1) (Nano-Glo® Luciferase Assay System, Promega). - (England et al., 2016) và trên gel SDS PAGE 15%. - Hình 1: Cơ chế phản ứng của protein NanoLuc và cơ chất Furimazine (England et al Thử nghiệm khả năng nhận diện kháng. - sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn của protein tín hiệu NanoLuc. - Hai micro lít của mỗi loại kháng sinh (5 mg/mL) gồm oxytetracycline, chloramphenicol và erythromycin được cho vào phản ứng tổng hợp protein NanoLuc, đối chứng dương là phản ứng chứa 2 µL nước cất và đối chứng âm là phản ứng không có chứa DNA khuôn (DNA mang gen mã hóa protein NanoLuc). - Sự tổng hợp và ức chế tổng hợp protein NanoLuc được xác định qua khả năng phát sáng của protein NanoLuc dưới tác dụng của cơ chất Furimazine (Nano-Glo® Luciferase Assay System, Promega). - Trong trường hợp có sự hiện diện của 1 trong 4 kháng sinh, sự tổng hợp protein NanoLuc sẽ bị ức chế, dẫn đến tín hiệu phát sáng yếu hoặc không có tín hiệu phát sáng. - Tín hiệu phát sáng được ghi. - nhận lại bằng máy chụp ảnh kỹ thuật số (Griss et al., 2014) và được xử lý bằng phần mềm Image J. - Plasmid mang gen mã hoá protein NanoLuc được xác định hàm lượng và thực hiện qui trình khuếch đại như mục 2.2. - Sản phẩm khuếch đại của gen mã hoá protein NanoLuc cho kết quả ghi nhận ở Hình 2A. - Kết quả cho thấy sản phẩm điện di đều hiện rõ vạch 759 bp, là sản phẩm đặc hiệu của NanoLuc. - Tuy nhiên ở điều kiện thử nghiệm, ngoài sản phẩm đặc hiệu, kết quả còn cho sản phẩm không đặc hiệu (Hình 2A).. - Hình 2: Kết quả thực hiện và chuẩn hoá qui trình PCR khuếch đại gen mã hoá protein Nluc (A)Kết quả thực hiện qui trình PCR khuếch đại gen mã hoá protein NLuc: giếng M: thang DNA, giếng 1: sản phẩm khuếch đại. - Để giảm bớt lượng sản phẩm không đặc hiệu, một số chỉ tiêu được điều chỉnh bao gồm: i) nhiệt độ gắn mồi (tăng từ 55ºC lên 57ºC và cho sản phẩm khuếch đại rõ, lượng sản phẩm phụ ít, Hình 2B), (ii) nồng độ mồi (giảm từ 0,2 µM xuống còn 0,1 µM và cho sản phẩm khuếch đại rõ, lượng sản phẩm tương đương, Hình 2C) và (iii) nồng độ Taq polymerase (giảm từ 2U/ phản ứng và cho sản phẩm khuếch đại tương đương ở 1U/ phản ứng). - qui trình cho sản phẩm đặc hiệu rõ, lượng sản phẩm không đặc hiệu giảm rõ rệt. - Mồi giữ vai trò quyết định để Taq DNA polymerase tổng hợp được sợi bổ sung, do đó mồi. - Ngoài ra, hiệu quả của phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ của mồi (He et al., 1994), nồng độ mồi quá cao sẽ làm tăng khả năng mồi bám vào trình tự không đặc hiệu hoặc mồi sẽ tự bám vào nhau (Lorenz, 2012). - Bên cạnh đó, hàm lượng Taq DNA polymerase cao có thể làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu (Bell and Demarini, 1991).. - 3.2 Xác định sự tổng hợp của protein NanoLuc trong điều kiện in vitro. - Quá trình tổng hợp protein NanoLuc trong điều kiện in vitro bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã protein (PUREfrex 2.0 kit), 50 ng DNA khuôn của gen mã hoá protein NanoLuc. - Sau khi ủ phản ứng ở 37ºC trong 2h, 2 µL của phản ứng được load vào gel SDS page 15% để kiểm tra sự hiện diện của protein NanoLuc. - Theo kết quả trên gel SDS page, sự hiện diện của NanoLuc ở khoảng 21 kDa (Hình 3A), phù hợp với trọng lượng phân tử của NanoLuc (England et al., 2016). - Bên cạnh đó, sự tổng hợp của protein NanoLuc được xác định thông qua sự phát sáng khi tác dụng với cơ chất Furimazine. - Kết quả cho thấy ở phản ứng có sự hiện diện của DNA khuôn, tín hiệu phát sáng được ghi nhận, ngược lại. - Cường độ phát sáng của protein NanoLuc được bán định lượng bằng phần mềm xử lý ảnh ImageJ (Hình 3B). - Các kết quả này chứng tỏ protein NanoLuc đã được tổng hợp thành công trong điều kiện in vitro.. - 3.3 Khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn của protein NanoLuc. - Để chứng minh cho tiềm năng phát triển cảm biến sinh học, khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn của protein NanoLuc được kiểm tra. - Nhóm kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn có thể được phân loại thành ba nhóm nhỏ, tùy thuộc vào vị trí gắn vào ribosome của chúng bao gồm (i) gắn vào tiểu đơn vị 30S (nhóm 1), (ii) gắn vào trung tâm peptidyl transferase trên tiểu đơn vị 50S (nhóm 2) và (iii) gắn vào đường thoát peptide trên tiểu đơn vị 50S (nhóm 3) (McCoy et al., 2011). - Nghiên cứu này tập trung vào kháng sinh đại diện từ ba nhóm và chọn oxytetracycline (OTC) cho nhóm 1, chloramphenicol (CHL) cho nhóm 2 và erythromycin (ERY) cho nhóm 3 vì oxytetracycline và erythromycin là 2 loại kháng sinh đang sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam trong khi chloramphenicol hiện đang được cấm sử dụng.. - Sau phản ứng tổng hợp protein, kết quả ghi nhận khi phản ứng với cơ chất Furimazine, không nhận thấy tín hiệu phát sáng ở cả 3 loại kháng sinh, trong khi đối chứng dương cho tín hiệu phát sáng bình thường (Hình 4A). - Điều này chứng tỏ protein NanoLuc bị ức chế tổng hợp ở mẫu có sự hiện diện của kháng sinh.. - Hình 3: Kết quả kiểm tra sự tổng hợp protein NanoLuc trong điều kiện in vitro. - (B) NanoLuc tác dụng với cơ chất Furimazine và phát sáng. - Nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm với một số kháng sinh đại diện cho nhóm có cơ chế hoạt động khác nhằm xác định tính đặc hiệu của protein NanoLuc, bao gồm nhóm ức chế sự tổng hợp thành tế bào, nhóm ức chế sự chuyển hoá acid folic, và nhóm ức chế sự tổng hợp acid nucleic (Kohanski et al., 2010). - Penicillin (PEN), sulfadiazine (SDZ) và enrofloxacin (ENR) lần lượt là đại diện cho 3 nhóm kháng sinh trên. - các kháng sinh đại diện không thuộc nhóm ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn đều cho tín hiệu phát sáng tương đương với đối chứng dương, trong khi mẫu thử nghiệm với chloramphenicol thì tín hiệu phát sáng gần như không phát hiện. - Điều này chứng tỏ các kháng sinh khác cơ chế không ảnh hưởng đến quá trình nhận biết nhóm kháng sinh mục tiêu của nghiên cứu.. - Hình 4: Kết quả kiểm tra khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn của protein NanoLuc. - (A) Khả năng nhận diện 3 loại kháng sinh đại diện gồm oxytetracycline, chloramphenicol và erythromycine. - (B) Tính đặc hiệu của protein NanoLuc khi thử nghiệm với một số kháng sinh có cơ chế hoạt động khác gồm penicillin, sulfadiazine và enrofloxacin.. - Trong những năm gần đây, tổng hợp protein trong điều kiện in vitro được chú ý nhiều hơn như là một nền tảng thay thế cho các tế bào sống, cung cấp môi trường đơn giản và dễ kiểm soát hơn để nghiên cứu hệ thống sinh học (Hodgman and Jewett, 2013).. - Hệ thống tổng hợp protein trong điều kiện in vitro hay còn gọi là hệ thống tổng hợp protein ngoài tế bào sống (cell-free protein synthesis), bao gồm các thành phần cần thiết để phiên mã, dịch mã và một cấu trúc DNA khuôn, cho phép chuyển phiên mã của một gen (Carlson et al., 2011). - Hầu hết thành phần của các hệ thống này đều có nguồn gốc từ vi khuẩn E. - coli (Carlson et al., 2011). - Hệ thống này có nhiều ứng dụng trong sinh học tổng hợp, đặc biệt là nền tảng cho thành phần sinh học của cảm biến sinh học (Pardee et al . - Slomovic et al., 2015), trong đó DNA khuôn thường được cấu trúc mang các gen mã hoá cho các. - NanoLuc là protein bổ sung mới nhất hệ thống các protein phát quang sinh học (England et al., 2016). - Người ta phát hiện ra rằng NanoLuc có khả năng phát sáng đặc biệt cao hơn FLuc và RLuc 150 lần (Hall et al., 2012). - Với những ưu điểm này, NanoLuc hiện đang được sử dụng như thành phần nhận biết trong cảm biến sinh học, đáng chú ý trong ứng dụng nhận diện kháng sinh trong chẩn đoán y học và trong môi trường. - (Duyen et al., 2017. - Griss et al., 2014. - Lowell et al., 2015).. - Protein NanoLuc được tổng hợp thành công trong điều kiện in vitro, có khả năng nhận diện được nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein vi khuẩn và có tính đặc hiệu cao. - Protein NanoLuc có tiềm năng phát triển thành cảm biến sinh học nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn trong môi trường nước.. - Tiếp tục khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein tín hiệu NanoLuc trong điều kiện in vitro như nhiệt độ, pH và nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.. - Griss, R., Schena, A., Reymond, L., et al., 2014.. - Hall, M.P., Unch, J., Binkowski, B.F., et al., 2012.. - Hoa, P.T.P., Managaki, S., Nakada, N.,et al., 2011.. - Lowell, A.N., Santoro, N., Swaney, S.M., et al., 2015.. - Pardee, K., Green, A.A., Ferrante, T., et al., 2014.. - Pardee, K., Green, A.A., Takahashi, M.K., et al., 2016. - Pham, D.K., Chu, J., Do, N.T., Brose, F., Degand, G., Delahaut, P., De Pauw, E., Douny, C., Van Nguyen, K., Vu, T.D., et al., 2015. - Uchida, K., Konishi, Y., Harada, K., et al., 2016.