- NGHIÊN CỨU THUỐC KHÁNG NẤM VÀ HÓA CHẤT. - Nghiên cứu mức độ tác động của bronopol, oxy già, formol và sodium hypochlorite đến khả năng phát triển của sợi nấm và bào tử của hai chủng nấm P. - Kết quả cho thấy hai chủng NJM0662 và NJM0672 kháng lại với sodium hypoclorite thể hiện ở nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là 800 và 1600 ppm. - Nồng độ ức chế tối thiểu của bronopol, formol và oxy già với sợi nấm và bào tử của cả hai chủng lần lượt là 50, 200 và 400 ppm. - Nồng độ kháng nấm tối thiểu của bronopol, formol và oxy già với sự phát triển của sợi nấm và bào tử của chủng NJM0662 lần lượt là 50, 150 và 400 và 50, 200 và 800 ppm, sau khi tiếp xúc 24 giờ. - Trong khi đó, nồng độ kháng nấm tối thiểu của bronopol, formol và oxy già với sự phát triển của sợi nấm và bào tử của chủng NJM0672 lần lượt là 50, 150 và 300 và 800, 400 và >1600 ppm sau khi tiếp xúc 24 giờ. - Như vậy, bronopol và oxy già là hai hóa chất hiệu quả. - oratosquillae, thuốc kháng nấm. - Trong đó, oxy già (H 2 O 2 ) là hóa chất thường được sử dụng trong phòng và trị vi nấm nhiễm ở trứng cá và cá nuôi thương phẩm (Dawson et al., 1994. - Như vậy, việc đánh giá tính nhạy của vi nấm đối với thuốc kháng nấm và nồng độ ức chế tối thiểu có ý nghĩa nhiều trong việc chọn lựa thuốc kháng nấm và nồng độ sử dụng phù hợp. - Chính vì thế, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng sử dụng của một số thuốc kháng nấm và hóa chất đối với hai loài vi nấm Plectosporium oratosquillae NJM0662 và Acremonium sp. - 2.2 Vật Liệu 2.2.1 Hóa chất. - Bốn loại hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: oxy già (H 2 O 2 ) (MGC, Nhật Bản). - 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy để thu bào tử. - Thu bào tử vi nấm bằng cách cho 10 ml nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa Petri đang nuôi cấy vi nấm, dùng que cấy cào nhẹ trên bề mặt của đĩa thạch để bào tử tách ra khỏi cuống sinh bào tử. - Huyền phù bào tử được lọc qua 2 lớp màng lọc y học tiệt trùng để thu bào tử nấm. - Mật số bào tử nấm được xác định bằng buồng đếm hồng cầu. - Mật số bào tử cao và thấp lần lượt là 10 4 và 10 2 bào tử/ml.. - 2.3.2 Ảnh hưởng hóa chất đến sự phát triển của vi nấm. - Khuẩn lạc: thí nghiệm ảnh hưởng của hóa chất đến khả năng phát triển của sợi nấm được thực hiện theo phương pháp của Kobayashi and Medoff (1983). - Nồng độ hóa chất căn cứ theo nghiên cứu của Kitancharoen et al. - Nồng độ của bronopol và formol là và 400 ppm. - Ở lô đối chứng thay thế dung dịch hóa chất bằng 2 ml nước biển nhân tạo. - Khả năng ức chế của hóa chất được tính bằng tỷ lệ phần trăm bằng (bán kính khuẩn lạc trên đĩa có hóa chất/Bán kính khuẩn lạc trên đĩa đối chứng) x 100.. - Bào tử nấm: căn cứ vào kết quả tác động ức chế của hóa chất đến khả năng phát triển của sợi nấm thì bronopol, formol và oxy già được sử dụng trong thí nghiệm này. - Các nồng độ của bronopol, formol và oxy già được sử dụng lần lượt là 25, 50 và 100 ppm, 50, 100 và 200 ppm và 100, 200 và 400 ppm. - Cách chuẩn bị môi trường có nồng độ hóa chất khác nhau được thực hiện như trên. - Lấy 50 µl dung dịch bào tử ở mật độ 10 4 bào tử/ml cho lên đĩa Petri trên và trải đều. - Ở lô đối chứng môi trường thạch PYGS không có hóa chất, ủ ở 25 o C, 1 tuần quan sát bào tử nảy mầm và ghi nhận kết quả. - 2.3.3 Tác dụng kháng vi nấm của hóa chất. - Khuẩn lạc: căn cứ vào kết quả tác động ức chế của hóa chất đến khả năng phát triển của sợi nấm thì bronopol, formol và oxy già được sử dụng trong thí nghiệm này với nồng độ tương ứng là và 500 ppm và 600 ppm và và 1000 ppm. - Ở lô đối chứng thay thế hóa chất bằng nước biển nhân tạo. - Mẫu agar-nấm được cắt như ở mục 2.3.2, rồi ngâm vào các đĩa Petri có các nồng độ hóa chất khác nhau trong thời gian và 720 phút. - Bào tử nấm: lấy 1 ml huyền phù bào tử ở mật số 10 3 và 10 4 bào tử/ml và 3 ml mỗi loại hóa chất bronopol, formol và oxy già với nồng độ áp dụng cho khuẩn lạc cho vào đĩa Petri chứa 26 ml nước biển nhân tạo. - Sau thời gian và 720 phút, lấy 50 µl huyền phù bào tử này nuôi cấy trên môi trường thạch PYGS, ủ ở 25 o C trong 15 ngày. - 2.4 Tính nhạy của thuốc kháng nấm 2.4.1 Thuốc kháng nấm và nồng độ sử dụng. - Nồng độ thuốc kháng nấm từ 0,031;. - 2.4.2 Dung dịch thuốc kháng nấm gốc và huyền phù bào tử nấm. - Dung dịch thuốc kháng nấm gốc được chuẩn bị theo mô tả trong NCCLS M38-A (Pfaller et al., 2002). - Huyền phù bào tử được chuẩn bị theo mô tả ở phần 2.3.1 và mật độ bào tử sử dụng là 10 5 bào tử/ml.. - Cho 100µl dung dịch bào tử nấm vào các giếng có chứa 100 µl thuốc kháng nấm đã được pha loãng 2 lần. - Nồng độ thuốc và mật số bào tử được pha loãng 2 lần. - Khay 96 giếng được ủ ở 25 o C để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng nấm với Acremonium sp. - Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory Concentration, MICs): nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng nấm ức chế khả năng phát triển của vi nấm. - Nồng độ kháng nấm tối thiểu (Minimum Fungicidal Concentration, MFC):. - nồng độ kháng nấm tối thiểu là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng nấm ở đó nấm không phát triển hoặc phát triển ít hơn 3 khuẩn lạc (nấm chết 99,9. - 3.1 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự phát triển của vi nấm 3.1.1 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự phát triển của khuẩn lạc. - Hợp chất bronopol hạn chế khả năng phát triển của hai loài vi nấm này tốt ở nồng độ 50 ppm (Bảng 1), trong khi đó formol và oxy già lần lượt ở nồng độ 200 ppm (Bảng 1) và 400 ppm (Bảng 2). - Ngược lại, nồng độ sodium hypoclorite hạn chế sự phát triển của chủng nấm NJM0662 và NJM0672 lần lượt ở 1.600 và 400 ppm (Bảng 2).. - Bảng 1: Ảnh hưởng của bronopol và formol đến khả năng phát triển khuẩn lạc Nồng độ. - b Tỷ lệ % bán kính khuẩn lạc trên đĩa môi trường với các nồng độ bronopol và formol khác nhau so với đĩa đối chứng.. - Bảng 2: Ảnh hưởng của Oxy già và sodium hypoclorite đến khả năng phát triển khuẩn lạc Nồng độ. - b Tỷ lệ % bán kính khuẩn lạc trên đĩa môi trường với các nồng độ oxy già và sodium hypoclorite khác nhau so với đĩa đối chứng.. - 3.1.2 Ảnh hưởng của hóa chất đến khả năng phát triển của bào tử nấm. - Nồng độ ức chế tối thiểu của bronopol, formol và oxy già đến hai chủng NJM0662 và NJM0672 lần lượt là 50, 200 và 400 ppm (Bảng 3).. - Bảng 3: Ảnh hưởng của hóa chất đến khả năng phát triển của bào tử nấm (10 4 bào tử/ml). - b Nồng độ ức chế tối thiểu (ppm).. - 3.2 Khả năng diệt vi nấm của hóa chất 3.2.1 Khả năng diệt sợi nấm của hóa chất. - Khả năng diệt sợi nấm khác nhau tùy vào loại hóa chất và thời gian hiệu lực. - Hóa chất bronopol và formol lần lượt ở nồng độ 50 và 150 ppm diệt hoàn toàn sợi nấm của hai chủng NJM0662 và NJM0672 ngâm trong 24 giờ (Bảng 4). - Tuy nhiên, oxy già cần nồng độ cao hơn để diệt hoàn toàn sợi nấm của 2 chủng NJM0662 và NJM672 lần lượt ở 400 và 300 ppm ngâm trong 24 giờ (Bảng 4).. - Bảng 4: Khả năng diệt vi nấm (khuẩn lạc và 10 4 bào tử/ml) của bronopol, formol và oxy già Chủng nấm a Thời gian tiếp xúc hóa chất. - NJM0662 Sợi nấm >500 b >500 > Bào tử >800 >800 > NJM0672 Sợi nấm >400 >400 > . - Bào tử >800 >800 > Formol. - NJM0662 Sợi nấm >600 >600 >600 >600 > Bào tử >1600 >1600 >1600 > NJM0672 Sợi nấm >600 >600 > . - Bào tử >1600 >1600 >1600 > Oxy già. - NJM0662 Sợi nấm >1000 >1000 >1000 >1000 > Bào tử >1600 >1600 >1600 > NJM0672 Sợi nấm >1000 >1000 >1000 > . - Bào tử >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600. - b Nồng độ diệt nấm tối thiểu (ppm).. - 3.2.2 Khả năng diệt bào tử nấm của hóa chất. - Khả năng diệt bào tử nấm tùy thuộc vào hóa chất và mật số bào tử. - Tuy nhiên, nồng độ hóa chất diệt bào tử nấm cao hơn nồng độ hóa chất diệt sợi nấm. - Hóa chất bronopol ở nồng độ 50 ppm diệt hoàn toàn bào tử nấm chủng NJM0662 ở mật số cao (10 4 bào tử/mL) và thấp (10 2 bào tử/mL) và chủng NJM0672 ở mật số bào tử cao và thấp lần lượt là 400 và 200 ppm, ngâm trong 24 giờ (Bảng 4 và 5). - Đối với formol ở nồng độ 200 và 400 ppm, ngâm 24 giờ, diệt hoàn toàn bào tử nấm ở mật số cao 10 4 bào tử/mL của 2 chủng nấm lần lượt là NJM0662 và NJM0672 (Bảng 4). - Trong khi đó hóa chất oxy già ở nồng độ 800 và >1.600 ppm, ngâm 24 giờ diệt hoàn toàn bào tử nấm ở mật số cao 10 4 bào tử/mL của 2 chủng nấm lần. - Bảng 5: Khả năng diệt bào tử nấm ở mật độ 10 2 bào tử/ml của bronopol và oxy già Chủng nấm a Thời gian tiếp xúc. - Oxy già. - b Nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) (ppm).. - Như vậy, ba loại hóa chất bronopol, formol và oxy già tác động đến khả năng phát triển của cả hai chủng nấm NJM0662 và NJM0672 nhưng sodium hypoclorite thì không ảnh hưởng. - Nhìn chung, nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ kháng nấm tối thiểu của các loại hóa chất đối với khả năng phát triển của nấm thấp hơn đối với bào tử nấm. - Trong số các nhóm hóa chất sử dụng, bronopol có hiệu quả kháng nấm cao nhất. - Nồng độ ức chế tối thiểu của bronopol với giống Saprolegnia là 100-200 ppm và với nồng độ 50-100 ppm thì bronopol có thể được sử dụng trong các trại giống bị nhiễm nấm (Oono et al., 2007. - Nồng độ ức chế tối thiểu của sodium hypoclorite là 1600 ppm, tuy nhiên với một nghiên cứu trên bào tử của nấm Fusarium incarnatum NJM0177 khi tiếp xúc với sodium hypoclorite ở nồng độ 500 ppm thì ức chế sự phát triển của sợi nấm (Khoa, 2005). - Bên cạnh đó, nồng độ của formol 400 ppm được đánh giá là có hiệu quả với loài Saprolegnia sp. - Ở nghiên cứu này cho thấy sau 24 giờ tiếp xúc của bào tử nấm ở mật số 10 2 bào tử/ml với oxy già trên hai chủng nấm NJM0662 và NJM0672 lần lượt là 400 và 800 ppm. - 3.3 Tính nhạy của thuốc kháng nấm. - Độ nhạy của 8 loại thuốc kháng nấm dùng trong thí nghiệm này thể hiện ở Bảng 6.. - Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ kháng nấm tối thiểu của amphotericin B đối với hai chủng NJM0662 và NJM0672 lần lượt là 0,125 và 0,25 ppm. - Nồng độ ức chế tối thiểu của terbinafine hydrochloride và voriconazole với chủng NJM0662 lần lượt là 1 và 0,25 ppm, nồng độ kháng nấm tối thiểu của terbinafine hydrochloride hoặc voriconazole với chủng NJM0662 là 2 ppm. - Tuy nhiên, với chủng NJM0672 nồng độ ức chế tối thiểu của terbinafine hydrochloride. - Bảng 6: Tác động của thuốc kháng nấm đối với hai chủng P. - NJM0672 Thuốc kháng nấm MIC a. - MIC: nồng độ ức chế tối thiểu. - MFC: nồng độ kháng nấm tối thiểu.. - Ba loại thuốc kháng nấm amphoterincin B, voriconazole và terbinafine hydrochloride có tác động lớn nhất với hai chủng nấm thí nghiệm.. - Nồng độ ức chế tối thiểu của amphotericin B là 0,25-2 mg/l có ý nghĩa với các nhóm nấm bấc toàn khác như Exophiala spinifera (Vitale et al., 2003). - Bronopol, oxy già và formol có hiệu quả ức chế khả năng phát triển của sợi nấm và bào tử của hai chủng nấm P. - Nồng độ ức chế tối thiểu của sodium hypoclorite với hai chủng nấm NJM0662 và NJM0672 lần lượt là 800 and 1600 ppm và của bronopol, formol và oxy già với sợi nấm và bào tử của cả hai chủng nấm lần lượt là 50, 200 và 400 ppm. - Nồng độ diệt nấm tối thiểu của bronopol, formol and oxy già tùy. - thuộc vào thời gian tiếp xúc của sợi nấm và bào tử nấm với mỗi loại hóa chất