- TỪ MỦ ĐU ĐỦ (Carica papaya) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Nguyễn Thị Hà 1. - Enzim protease, Sắc ký trao đổi ion, sắc ký tương tác kỵ nước. - Sắc ký trao đổi ion với giá thể gel SP-Streamline kết hợp với sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể gel Phenil-Sepharoz có thể tinh sạch được một trong các thành phần enzyme trong mủ đu đủ. - Thêm vào đó, do nguồn papain dồi dào, gel dùng để chạy sắc ký có thể tái sử dụng nhiều lần, vì vậy gía thành thấp hơn papain thương mại. - Tuy nhiên phương pháp này khó tách rửa enzyme có hàm lượng lớn và phải sử dụng một lượng lớn dung dịch đệm để tách rửa nên nồng độ enzyme thu được sau khi qua cột rất loãng, có thể nên kết hợp sử dụng phương pháp siêu lọc để tách muối đồng thời có hoạt tính enzyme tốt hơn. - Xử lý dung dịch enzyme với 2-PDS trước khi cho qua cột sắc ký trao đổi ion có thể bảo vệ enzyme tránh tình trạng tự phân giải trong quá trình tinh sạch.. - Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng trên các giá thể khác nhau như cột trao đổi ion, cột sắc ký ái lực hấp phụ hay cột sắc ký tương tác kỵ nước (Zucker và ctv. - 1994) có thể tinh sạch các enzim từ mủ đu đủ.. - Mủ đu đủ. - 2.2 Phương pháp. - Sắc ký trao đổi ion. - Trong phương pháp này sự phân tách dựa vào nguyên lý tương tác của các điện tích trên bề mặt của phân tử protein trong dung dịch với các nhóm trao đổi ion (nhóm mang điện tích) trên chất rắn (giá thể) ở các mức độ khác nhau. - Có hai loại giá thể dùng trong sắc ký trao đổi ion: Chất trao đổi ion âm (anion exchanger) là những chất mang nhóm điện tích dương. - sẽ tương tác với các ion âm. - sẽ tương tác với các ion dương. - Trong quá trình sắc ký, các phân tử protein trong dung dịch sẽ liên kết trao đổi ion thuận nghịch với giá thể. - Các protein không bám sẽ đi ra trước theo dòng dung dịch đệm, các protein tạo liên kết ion bám lại trên giá thể sẽ được rửa giải hoặc bằng dung dịch đệm với gradien nồng độ muối hoặc gradien pH tăng dần (continuous gradient) hay tuần tự được rửa giải bằng các dung dịch đệm có nồng độ muối hay pH khác nhau (stepwise).. - Các protein sẽ được đẩy ra tuần tự dựa vào mức độ tích điện của protein, nói một cách khác dựa vào sự tương tác mạnh hay yếu giữa protein và giá thể.. - Các protein có độ tích điện thấp, mức độ tương tác yếu sẽ được đẩy ra trước. - Các protein có độ tích điện cao, mức độ tương tác mạnh hơn sẽ được đẩy ra sau.. - Sắc ký ái lực hấp phụ (Affinity chromatography - AC). - Sắc ký ái lực hấp phụ được thực hiện dựa trên nguyên lý tương tác đặc hiệu thuận nghịch giữa protein cần tinh sạch trong hỗn hợp với nhóm chức năng của giá thể. - Các tương tác đặc hiệu có thể là tương tác giữa enzim - cơ chất, enzim-chất ức chế, kháng nguyên - kháng thể, DNA-protein… Phương. - Các protein bám lại trên giá thể có thể rửa giải bằng nhiều cách như thay đổi pH, nồng độ muối hay dùng chất cạnh tranh, do có cùng bản chất với nhóm chức năng của giá thể, chất cạnh tranh sẽ đẩy protein tách khỏi giá thể.. - Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography -HIC). - Sắc ký tương tác kỵ nước được thực hiện dựa trên nguyên lý tương tác kỵ nước giữa các nhóm kỵ nước trên bề mặt của protein cần phân tách với các nhóm kỵ nước trên giá thể sử dụng. - Trong môi trường có nồng độ muối cao, phân tử protein bị mất lớp áo nước bao quanh, các nhóm kỵ nước lộ ra bên ngoài và sẽ tương tác với các gốc kỵ nước của giá thể. - Protein bám lại trên giá thể sẽ được rửa giải bằng cách dùng gradien nồng độ muối giảm dần hay dùng gradien nồng độ tăng dần của chất hữu cơ như ethylen glycol (50-80. - Sắc ký lọc gel hay sắc ký rây phân tử (Gel filtration hay Size Exclusion Chromatography). - Phương pháp sắc ký lọc gel dùng để phân tách protein dựa vào khả năng khác nhau về kích thước phân tử của chúng. - Nguyên lý của sắc ký lọc gel là dựa trên sự phân bố của protein giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các lỗ của các hạt. - Khi dòng pha động liên tục đi qua, các phân tử nhỏ lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động và như vậy ta sẽ tách được từng phân đoạn các phân tử có kích thước phân tử khác nhau, lớn ra trước, nhỏ ra sau.. - 3.2 Sắc ký trao đổi ion trên cột SP-Streamline Dung dịch enzim trích ly từ mủ đu đủ được xử. - lý với 2-PDS sau khi qua cột sắc ký với giá thể trao đổi ion SP-Streamline. - Kết quả cho thấy tính đa dạng của thành phần các enzim trong mủ đu đủ (Hình 2). - Các protein được phân tách thành bốn phân đoạn, phân đoạn UB là các protein không bám trên giá thể, phân đoạn này không có hoạt tính enzim và lượng protein rất ít. - Các phân đoạn I, II và III được rửa giải với các dung dịch đệm với nồng độ muối tương ứng là 0.25M, 0.35M và 0.6M NaCl.. - Hình 2: Sắc ký đồ của dung dịch enzim papain trích ly từ mủ đu đủ được xử lý với 2-PDS trên cột SP-Streamline, dung dịch đệm ammonium acetat 0.1M, pH 5.0 có chứa 5mM EDTA và 0.5mM. - Ghi chú: UB: phân đoạn protein không bám trên giá thể. - I: phân đoạn 0.25M NaCl. - II: phân đoạn 0.35M NaC. - III: phân đoạn 0.6M NaCL. - Phân đoạn sắc ký. - Kết quả này tương tự như kết quả của Dekeyser (1994) với giá thể trao đổi ion là Mono S 5/5. - Phân đoạn I ứng với enzim papain với hàm lượng thấp chỉ khoảng 11% tổng protein, phân đoạn II ứng với enzim chymopapain chiếm phần lớn trong tổng protein, khoảng 60. - trong phân đoạn này có lẫn enzim papaya proteinaz IV. - Phân đoạn III ứng với enzim papaya proteinaz III, chiếm. - 3.3 Sắc ký ái lực hấp thụ với giá thể là gel Bacitracin-Eupergit C. - Do các phân đoạn protein nhận được sau khi qua cột trao đổi ion còn khá phức tạp. - Để tách các enzim ra khỏi các protein tạp, dùng phương pháp sắc ký ái lực hấp thụ với giá thể là gel Bacitracin- Eupergit C.. - Hình 3: Sắc ký đồ của các phân đoạn enzim papain trên cột sắc ký Bacitracin-Eupergit C Chú thích. - a: phân đoạn I, 0.25M NaCl. - b: Phân đoạn II, 0.35M NaCL. - c: phân đoạn III, 0.6M NaCl.. - Các phân đoạn enzim I, II, III nhận được qua cột sắc ký trao đổi ion được tiếp tục cho qua cột sắc ký ái lực hấp thụ Bacitracin-Eupergit C.. - Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy cả ba phân đoạn sau khi qua cột ái lực hấp phụ bacitracin- Eupergit đều cho một phân đoạn duy nhất (Hình 3), tương tự như kết quả nhận được của Stepanov. - Tuy nhiên, khi phân tích điện di trên gel SDS-PAGE (Laemmli, 1970) cho thấy enzim chưa tách được ra khỏi các protein tạp (Hình 4), các protein tạp lẫn enzim trong phân đoạn đều bám vào giá thể và được rửa giải cùng một lúc. - Hình 4: Điện di đồ các phân đoạn enzim papain nhận được sau khi qua cột sắc ký Bacitracin- Eupergit C. - 2, 9 và 10: phân đoạn 0.6M NaCl. - 3 và 4: phân đoạn 0.25M NaCl. - 5, 6,7 và 8: phân đoạn 0.35M NaCl.. - 3.4 Sắc ký lọc gel với giá thể gel Sephadex G25 Theo Kyden (1998) có khả năng các protein tạp là sản phẩm phân giải của enzim có mang nhóm – SH tự do trong phân tử sẽ liên kết với enzim qua các cầu nối disulfit, vì vậy các phân đoạn enzim sẽ được xử lý trước với hợp chất có tính khử là Ditiotreitol để phá vỡ các cầu nối disulfit này và. - sau đó cho qua cột sắc ký lọc gel nhằm tách các protein có khối lượng phân tử thấp. - Tuy nhiên, kết quả nhận được trên sắc ký lọc gel cũng chỉ có một phân đoạn protein duy nhất, điện di trên gel SDS- PAGE cho thấy là các enzim vẫn chưa tách được ra khỏi các protein tạp. - Các dải băng protein khối lượng phân tử thấp vẫn hiện diện trong phân đoạn có chứa enzim (Hình 5).. - Hình 5: Điện di đồ các phân đoạn enzim nhận được sau khi qua cột sắc ký Sephadex G 25 Chú thích: 1. - 2,3 và 4: phân đoạn 0.25M NaCl. - 5 và 6: phân đoạn 0.35M NaCl. - 7 và 8: phân đoạn 0.6M NaCl. - 3.5 Sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể Phenil –Sepharoz. - Do các phương pháp như trên không đạt hiệu quả trong việc tinh sạch enzim, cần có một phương pháp thích hợp và đặc hiệu để có thể tách được enzim ra khỏi hỗn hợp, phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể là Phenil –Sepharoz đã được áp dụng. - Dung dịch enzim sau khi qua cột sắc ký tương tác kỵ nước, các protein bám vào giá thể được rửa giải bằng các gradien nồng độ muối khác nhau.. - Phân đoạn 0.35M NaCl thu được sau khi qua cột SP-Streamline, là phân đoạn có chứa enzim chymopapain và papaya proteinaz III, được cho qua cột sắc ký tương tác kỵ nước Phenil –Sepharoz voi nồng độ ammonium sulfat ban đầu trong dung dịch protein là 1,0M. - Các protein bám lại trên giá thể được rửa giải với gradien nồng độ muối giảm dần từ 1.0-0.0M ammonium sulfat. - Qua sắc ký đồ (Hình 6) nhận thấy có 3 phân đoạn protein được tách ra, trong đó phân đoạn 1 và 2 có hoạt tính enzim.. - Hình 6: Sắc ký đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, gradien nồng độ ammonium sulfat 1.0M-0.0M. - Tuy nhiên, kết quả điện di trên gel SDS-PAGE (Hình 7) cho thấy trong các phân đoạn enzim vẫn còn lẫn protein tạp. - Có thể muối ammonium sulfat. - Hình 7: Điện di đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, gradien nồng độ ammonium sulfat 1.0M-0.0M. - 2 và 5: phân đoạn 1. - 3 và 6: phân đoạn 2. - 4 và 7: phân đoạn 3. - 3.5.2 Rửa giải protein với gradien nồng độ muối ammonium sulfat từ 1.5-0.0M.. - Kết quả trên sắc ký đồ (Hình 8) cho thấy khi tăng nồng độ muối đến 1.5M ammonium sulfat. - trong dung dịch protein trước khi qua cột và rửa giải protein với gradien Ammonium sulfat từ 1,5- 0,0M, thành phần protein sau khi qua cột HIC cũng phân tách thành 3 phân đoạn.. - Hình 8: Sắc ký đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz với gradien (NH 4 ) 2 SO 4 từ 1.5M-0.0M. - Hình 9: Điện di đồ phân đoạn 0.35M NaCl qua cột Phenil –Sepharoz, với gradien nồng độ ammonium sulfat 1.5M-0.0M. - 2,3 và 4: phân đoạn 0.35M NaCl trước khi qua cột HIC. - 6: phân đoạn 2. - 7: phân đoạn 3. - Như vậy, kết hợp hai phương pháp sắc ký trao đổi ion trên giá thể SP-Streamline và sắc ký tương tác kỵ nước trên giá thể Phenil-Sepharoz phân đoạn enzim 0.35M NaCl, có khả năng đây là phân đoạn enzim chymopapain đã được tinh sạch từ mủ đu đủ. - Tuy nhiên, do các enzim trong mủ đu đủ có. - Bên cạnh đó, cần phải nghiên cứu thêm về việc nâng qui trình tinh sạch lên phạm vi lớn hơn, đối với cột trao đổi ion, việc nâng cấp lên phạm vi tinh sạch lớn đã được nghiên cứu và có thể thực hiện được, tuy nhiên đối với cột sắc ký. - tương tác kỵ nước cần phải được nghiên cứu tiếp tục.. - Mủ đu đủ có thể thu hoạch từ trái trong khoảng từ 8-10 tuần tuổi để thu được enzim với hoạt tính và hiệu suất cao. - Sắc ký trao đổi ion với giá thể gel SP-Streamline kết hợp với sắc ký tương tác kỵ nước với giá thể gel Phenil-Sepharoz có thể được dùng để tinh sạch enzim trong mủ đu đủ. - Thêm vào đó, do nguồn papain của chúng ta dồi dào, gel dùng để chạy sắc ký có thể tái sử dụng nhiều lần, vì vậy giá thành sẽ thấp hơn papain thương mại.. - Mặt khác, ta sử dụng một lượng lớn dung dịch đệm để tách rửa nên nồng độ enzim thu được sau khi qua cột rất loãng, có thể nên kết hợp sử dụng phương pháp siêu lọc để tách muối đồng thời có hoạt tính enzyme tốt hơn. - Xử lý dung dịch enzim với 2-PDS trước khi cho qua cột sắc ký trao đổi ion có thể bảo vệ enzim tránh tình trạng tự phân giải trong quá trình tinh sạch.. - Đu đủ lạ hay quen