- Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định N. - Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N. - Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. - Phương pháp phân lập vi khuẩn hòa tan phosphate. - Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hòa tan phosphate của các chủng nấm mốc. - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định N từ đất vùng RNM tại Thừa Thiên Huế. - 2.1 Tìm hiểu sự phân bố vi khuẩn cố định N ở vùng rễ cây ngập mặn. - 2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N. - 2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực cố định N cao. - 3.2 Phân lập các chủng nấm mốc có khả năng hòa tan P. - Tạo chế phẩm vi sinh vật từ các chủng vi khuẩn cố định N và hòa tan phosphate. - 5.1 Thăm dò khả năng chuyển hóa N của chủng vi khuẩn cố định N. - 5.2 Thăm dò khả năng chuyển hóa P của chủng nấm mốc hòa tan phosphate. - Số lượng vi khuẩn cố định N tại vùng rễ cây ngập mặn tại TT Huế. - Kết quả sơ tuyển các chủng vi khuẩn cố định N. - Hàm lượng N-NH 4 + tổng hợp của các chủng vi khuẩn được sơ tuyển. - Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng N 27. - Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng và cố định N của chủng N 27. - Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate của chủng nấm mốc M 1 33. - Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate của M 1 33. - Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate của M 1 33. - Ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate của chủng M 1 33. - Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate của chủng nấm mốc M 1 33. - 67 Bảng 20: Sự thay đổi hàm lượng N trong đất khi bón chế phẩm vi khuẩn cố định N (lô thí nghiệm với cây Đước. - 69 Bảng 21: Sự thay đổi hàm lượng N trong đất khi bón chế phẩm vi khuẩn cố định N (lô thí nghiệm với cây Bần. - Phân lập vi khuẩn trên môi trường Ashby thạch đĩa. - Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hòa tan phosphate của chủng M 1 33. - Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng hòa tan phosphate của chủng M 1 33. - Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng hòa tan phosphate của chủng M 1 33. - Ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng hòa tan P của chủng M 1 33. - Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng hòa tan phosphate của chủng M 1 33. - Đặc biệt, vi khuẩn cố định N hiếu khí sống tự do và nấm mốc hòa tan P chịu trách nhiệm chính cho dinh dưỡng của cây ngập mặn. - Tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn hiếu khí sống tự do có khả năng cố định N và các chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ trong đất rừng ngập mặn tại Thừa Thiên Huế.. - Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen hiếu khí sống tự do và các chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ được phân lập từ mẫu đất vùng rễ của một số loài cây ngập mặn ở Thừa Thiên Huế. - Vi khuẩn cố định N. - Nhóm vi khuẩn có khả năng này được gọi là vi khuẩn cố định N.. - Phân loại các nhóm vi khuẩn cố định N. - Vi khuẩn cố định N sống cộng sinh. - Hầu hết các vi khuẩn cố định N là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu. - Vi khuẩn cố định N sống tự do. - Vi khuẩn cố định N tương tác với thực vật ký chủ. - Vai trò của vi khuẩn cố định N. - Chính nhờ khả năng cố định N mà vai trò của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa hết sức quan trọng trong nông nghiệp. - Đây là vai trò có ý nghĩa quan trọng nhất của vi khuẩn cố định N đối với nông nghiệp.. - Trong hệ sinh thái RNM, vi khuẩn cố định N có vai trò vô cùng quan trọng đối với sự phát triển của cây ngập mặn. - 15 - Nhóm vi khuẩn nitrite hóa. - Nhóm vi khuẩn nitrate hóa. - Nấm mốc hòa tan phosphate. - Ở nấm mốc Penicillium bilaji cũng có khả năng hòa tan phosphate tương tự như A.. - Các nhóm vi sinh vật khác có khả năng hòa tan phosphate. - Vi khuẩn hòa tan phosphate là một nhóm vi khuẩn có lợi, có khả năng hòa tan các hợp chất phosphate vô cơ và hữu cơ ở dạng không hòa tan. - Vi khuẩn hòa tan phosphate vô cơ là đối tượng được nghiên cứu sớm nhất.. - Các loài vi khuẩn đã được thử nghiệm khả năng hòa tan phosphate vô cơ bao gồm: Micrococcus radiatus, Flavobacterium auranticus, Pseudomonas radiobacter. - Ngoài ra còn có các vi khuẩn như B. - fosmis, Thiobacillus thiooxidans cũng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ. - Đối với vi khuẩn hòa tan phosphate hữu cơ chủ yếu thuộc các giống Bacillus và Pseudomonas.. - Các vi khuẩn nitrate hóa, sulfate hóa hay các vi sinh vật lên men lactic, acetic ở trong đất cũng có khả năng hòa tan phosphate mạnh. - Các vi khuẩn nitrate sống trong đất cũng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ do nó có khả năng oxy hóa NH 3 thành NO 2 - và NO 3. - Các vi khuẩn sulfate cũng có khả năng hòa tan phosphate khó tan do sự hình thành H 2 SO 4 trong qua trình trao đổi chất:. - cũng có khả năng hòa tan phosphate khó tan [32].. - Trong điều kiện môi trường kém thoáng khí đều giảm khả năng sinh trưởng phát triển và hòa tan phosphate [18]. - Vi khuẩn cố định N có rất nhiều ở vùng đất ngập. - Ví dụ: các vi khuẩn không cố định N thuộc chủng Staphylococcus sp. - Mẫu đất, mẫu rễ, các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N hiếu khí sống tự do và các chủng nấm mốc có khả năng hòa tan phosphate vô cơ được phân lập từ đất vùng rễ của một số cây ngập mặn tại các vùng RNM của Thừa Thiên Huế như Chá (Excoecaria agallocha L.) Griff. - Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định N 2.4.1. - Phân lập vi khuẩn theo phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa (phương pháp Koch). - Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N Tiến hành nuôi cấy trực tiếp các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Ashby thạch đĩa. - Chọn các chủng vi khuẩn có kích thước khuẩn lạc lớn. - Nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trong 50 mL. - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hàm lượng N-NH 4 + được cố định cao làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.. - Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển. - Để đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng vi khuẩn được tuyển chọn, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm gián tiếp số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa.. - Phương pháp đánh giá khả năng cố định N. - Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Ashby dịch thể ở nhiệt độ phòng. - Sau các khoảng thời gian khác nhau ngày, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.. - Nuôi ở 30 o C, sau thời gian nuôi cấy thích hợp, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.. - Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Ashby dịch thể, với các giá trị pH lần lượt: 5. - Thu nhận sinh khối và tạo các chế phẩm (10 9 tế bào/mL) tương ứng từ quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn cố định N và nấm mốc hòa tan phosphate được tuyển chọn tại điều kiện nuôi cấy tối ưu.. - Vì vậy, vai trò của vi khuẩn cố định N hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của hệ thực vật RNM.. - 2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực cố định N cao 2.3.1 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn cố định N. - Để đánh giá khả năng cố định N, 60 chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường Ashby thạch nghiêng. - các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N yếu cũng chiếm tỷ lệ khá lớn (32,5. - 2.3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực cố định N cao. - Tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định N mạnh nhất trong số 05 chủng đã sơ tuyển, kết quả được trình bày ở bảng 7.. - Xác định thời gian tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn N 27 , kết quả được trình bày ở bảng 8, hình 7 và 8.. - Trong khi đó, Đỗ Kim Nhung và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng cố định của 12 dòng vi khuẩn Azospirillium sp. - Xác định pH môi trường tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn N 27 , kết quả được trình bày ở bảng 9, hình 9 và 10.. - Xác định nguồn N của môi trường nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn N 27 , kết quả được trình bày ở bảng 10, hình 11 và 12.. - tạo nên điều kiện tối ưu cho môi trường sống của vi khuẩn.. - Theo Usha và cộng sự (2011), 5 chủng vi khuẩn Azospirillum sp. - Tiến hành phân lập các chủng nấm mốc có khả năng hòa tan phosphate từ mẫu đất ở RNM Rú Chá trên môi trường Czapek thạch đĩa có bổ sung phosphate ở dạng khó tan, kết quả xác định số lượng của vi khuẩn hòa tan phosphate ở vùng rễ một số cây ngập mặn được trình bày ở bảng 12.. - Phân lập các chủng nấm mốc có khả năng hòa tan P. - Tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng hòa tan phosphate mạnh nhất trong số 10 chủng đã sơ tuyển, kết quả được trình bày ở bảng 14.. - Trong đó có chủng M 1 33 là chủng có khả năng hòa tan phosphate (lượng phosphate hòa tan là 2,07 mg/ml) và sinh trưởng phát triển trên thạch đĩa mạnh (đường kính khuẩn lạc chủng M 1 33 đạt 5,3 cm). - 4 Tạo chế phẩm vi sinh vật từ các chủng vi khuẩn cố định N và hòa tan phosphate. - Tiến hành nhân giống chủng vi khuẩn cố định N (kí hiệu chủng N 27 ) và nấm mốc hòa tan phosphate (kí hiệu chủng M 1 33 ) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển và hoạt lực cố định N (hoặc hòa tan phosphate khó tan) đã được xác định, cụ thể là:. - Thăm dò khả năng chuyển hóa N của chủng vi khuẩn cố định N 5.1.1. - Tiến hành bón chế phẩm vi khuẩn cố định N vào các mẫu đất trồng cây ngập mặn (chủng N 27 ) theo phương pháp đã nêu. - Thăm dò khả năng chuyển hóa P của chủng nấm mốc hòa tan phosphate. - Từ 14 mẫu đất ở vùng RNM Rú Chá, và RNM Cảnh Dương đã phân lập được 40 chủng vi khuẩn có khả năng cố định N