- NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC. - GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM. - Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự. - Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự. - Giám định ADN. - Các kỹ thuật tách chiết ADN. - Phương pháp tách chiết hữu cơ (phương pháp tách chiết bằng phenol/. - Phương pháp tách chiết bằng chelex. - Phương pháp tách chiết bằng cột silica. - Phương pháp tách chiết bằng bộ kit PrepFiler®Error! Bookmark not defined.. - Cấu tạo xƣơng, răng ngƣời và cơ sở để phân tích ADN xƣơng, răng . - Phân tích ADN từ xương người. - Cơ sở để sử dụng bộ kit PrepFiler® trong việc tách chiết ADN từ hài cốt để phục vụ giám định ADN trong khoa học hình sựError! Bookmark not defined.. - Các bộ kit khác có thể sử dụng để tách chiết ADN từ mẫu răng , xƣơng. - Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm. - Dụng cụ thí nghiệm. - Hóa chất thí nghiệm. - Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kit PrepFiler®Error! Bookmark not defined.. - Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết. - Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR. - Điện di và phân tích kết quả. - Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - Kết quả định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiếtError! Bookmark not defined.. - Kết quả điện di đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian dƣới 2 năm. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 1. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 2. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 3. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 4. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 5. - Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời gian dưới 02 năm. - Kết quả tách chiết đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian từ 02 - 10 năm. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 6. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 7. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 8. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 9. - Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 10. - Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời gian từ 02 đến 10 năm. - So sánh kết quả phân tích ADN ở các mẫu hài cốtError! Bookmark not defined.. - Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler®. - Bố trí thí nghiệm đối với nhóm hài cốt có thời gian dưới 02 năm Bảng 2.2. - Bố trí thí nghiệm đối với nhóm hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm Bảng 2.3. - Thành phần của phản ứng PCR sử dụng bộ kit Identifiler Bảng 2.5. - Thành phần của phản ứng PCR sử dụng bộ kit Identifiler Bảng 2.7. - Kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5 đối với các mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm. - Kết quả định lượng ADN tổng số từ thì nghiệm 6 đến thí nghiệm 10 đối với các mẫu hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm. - Hình ảnh phân tích kết quả điện di bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.2 Hình 1.2. - Bô ̣ kit PrepFiler®. - Tỉ lệ thành công khi phân tích ADN ti thể tại các vị trí xương khác nhau trên cơ thể người. - Ảnh kết quả Realtime PCR trên máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ). - So sánh kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 4 đối với mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm (răng số 1 và xương số 1). - So sánh kết quả định lượng ADN tổng số giữa thí nghiệm 3,6,7,8 và 9 Hình 3.3. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 1 - răng số 1. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 2 - răng số 1 Hình 3.5. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 3 - xương số 1 Hình 3.6. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 4 - răng số 1 Hình 3.7. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 2 Hình 3.8. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 3 Hình 3.9. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 6 - răng số 4. - Hình 3.10. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - răng số 4 Hình 3.11. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - xương số 4 Hình 3.12. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 8 - răng số 4 Hình 3.12. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 9 - răng số 4 Hình 3.12. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số 5 Hình 3.12. - Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số. - Ngày nay, nhờ có sự phát triển của công nghệ sinh học, với việc tìm ra cách tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào ở nhân tế bào người, khi ứng dụng vào công tác điều tra, các điều tra viên có thể truy nguyên cá thể một cách chính xác thông qua những dấu vết tưởng chừng như rất nhỏ mà thủ phạm để lại như dấu vết máu, tế bào trên đầu lọc thuốc lá, bã kẹo cao su.... - Khi đó việc giám định ADN từ các mẫu mô là rất khó khăn do tử thi đã bị thối rữa nhiều tháng, thậm chí đã phân hủy hoàn toàn qua nhiều năm, chỉ có thể giám định ADN thông qua răng và xương còn sót lại của nạn nhân. - Tuy nhiên, với các mẫu hài cốt, việc phân tích ADN nhân tế bào gặp rất nhiều khó khăn, nhưng bù lại nếu phân tích được, dù chỉ một vài locus cũng rất có giá trị,. - thậm chí giá trị truy nguyên còn cao hơn cả việc phân tích được toàn bộ gen ty thể của hài cốt đó. - Đặc biệt đối với việc xác định danh tính hài cốt liệt sĩ, nếu chỉ giám định bằng hệ gen ty thể thì không thể phân biệt từng cá thể do đặc điểm di truyền theo dòng mẹ. - Mặt khác, đối với các hài cốt liệt sĩ thì lượng răng và xương thu được là hạn chế, nên cần phải tiến hành phân tích trên lượng mẫu tối thiểu do đó việc lựa chọn một quy trình tách chiết hiệu quả là bước quyết định sự thành công trong công tác giám định ADN nhân tế bào từ các mẫu hài cốt.. - Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết ADN từ những dấu vết có số lượng ít, chất lượng thấp (hay còn được gọi là vi vết) như: dấu vết tế bào để lại thông qua việc cầm, nắm hay dấu vết nước bọt trên miệng chai nước, trên đầu lọc thuốc lá. - cho kết quả tốt. - Vậy có thể sử dụng bộ kit này để tách chiết ADN từ hài cốt, một đối tượng cũng có hàm lượng ADN thấp và rất khó tách chiết hay không?. - Để góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, việc lựa chọn đề tài ‘Nghiên cứu ứng dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN tại Việt Nam’ với mong muốn nâng cao hiệu quả của việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương là rất cần thiết.. - Phân tích, đánh giá việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt.. - Đưa ra được quy trình tối ưu nhằm sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt để phục vụ công tác giám định ADN hình sự.. - Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN tốt nhất.. - Tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler®.. - Thiết kế các mô hình thí nghiệm để tìm phương pháp tách chiết tối ưu.. - So sánh hiệu quả tách chiết ADN nhân tế bào từ các mẫu hài cốt khác nhau (răng và xương).. - Nghiên cứu việc tách chiết ADN nhân tế bào bằng bộ kit PrepFiler đối với các mẫu răng và xương thu từ các bộ hài cốt có thời gian từ 1 - 10 năm tính từ khi nạn nhân bị chết.. - Tách chiết ADN nhân tế bào từ răng xương bằng bộ kit PrepFiler®.. - Định lượng sản phẩm ADN sau khi tách chiết.. - Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR.. - Điện di và phân tích ADN thu được.. - Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt.. - Đưa ra được quy trình tối ưu sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN từ hài cốt nói riêng và giám định ADN hình sự nói chung. - Từ đó ứng dụng vào thực tế phân tích ADN hài cốt trong các vụ án hình sự.. - Đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN tốt nhất.. - Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự 1.1.1. - Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. - Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). - Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng. - Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46. - Kỹ thuật để Jeffreys phân tích các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP. - Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong ADN của người. - Nguyễn Văn Hà (2011), Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN ti thể từ răng, xương người phục vụ giám định ADN ti thể trong điều kiện Việt Nam, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Viện Khoa học hình sự, Tổng cục cảnh sát phòng chống tội phạm, Bộ Công an.. - Hà Quốc Khanh, Nguyễn Văn Hà (2007), Giám định ADN, Viê ̣n khoa ho ̣c hình sự, 5. - Phát hiện, thu, bảo quản, nghiên cứu và giám định dấu vết sinh vật, NXB Công an Nhân dân.