- NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN ĐỂ ỨC CHẾ NẤM COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES PHÂN LẬP TỪ XOÀI CÁT HÒA LỘC BỊ BỆNH THÁN THƯ Lê Nguyễn Đoan Duy 1 , Nguyễn Thị Kim Tuyến 1 , Lương Tố Lan 1 và Nguyễn Công Hà 1. - Nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát khả năng của chitosan trong việc ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài cát Hòa Lộc ở những điều kiện khác nhau. - Thông qua nội dung nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm như điều kiện pH, nồng độ chitosan đã được khảo sát. - Qua quá trình tiến hành phân lập nấm C. - gloeosporioides đã quan sát được đặc điểm hình thái học, bào tử, khả năng phát triển và thời gian gây bệnh của nấm. - Kết quả giải trình tự chuỗi gen 28S rRNA và so sánh trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST cho thấy chủng nấm phân lập là C. - Từ các kết quả thí nghiệm tiến hành ức chế nấm mốc trên môi trường PDA, đối với môi trường ức chế PDA đặc thì nấm C. - gloeosporioides bị ức chế tốt nhất ở pH là 5 và nồng độ chitosan 1%. - Dựa vào kết quả in vitro, nghiên cứu tiến hành gây nhiễm nấm nhân tạo trên trái và khả năng ức chế của chitosan với nấm C. - Kết quả cho thấy là chitosan có khả năng ức chế nấm trên trái đã gây nhiễm nhân tạo.. - Một trong những bệnh sau thu hoạch thường gặp là bệnh thán thư (anthracnose) do sự phát triển của nấm C.. - bằng phương pháp deacetyl hóa bằng nhiệt hóa trong môi trường kiềm (Tolamite et al., 2000) và được sử dụng trong y học hoặc sản phẩm công nghiệp như một chất có hoạt tính sinh học (Cho et al, 2008;. - Một số nghiên cứu đã cho thấy là chitosan có khả năng trì hoãn bệnh thán thư sau thu hoạch (Ali et al., 2010). - Nghiên cứu nhằm mục đích phân lập nấm C. - gloeosporioides trên xoài bị bệnh ở ĐBSCL, sau đó khảo sát khả năng ức chế dòng nấm này của chitosan. - Dựa vào kết quả thu được trong phòng thí nghiệm, nghiên cứu sẽ tiến hành lây nhiễm nhân tạo dòng nấm này lên xoài và tiến hành kiểm tra khả năng ức chế trực tiếp trên xoài của chitosan.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và hóa chất. - Môi trường PDA (Potato dextrose agar) và WA (Water agar) do công ty Merck (Đức) cung cấp.. - 2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.1 Phân lập nấm C. - Đầu tiên, tiến hành thu thập mẫu xoài bệnh, sau đó quan sát triệu chứng hình dạng vết bệnh, soi mẫu tươi để xem khuẩn ty, bào tử nấm. - Tiến hành phân lập và nuôi cấy trên môi trường PDA và WA để có được dòng nấm thuần chủng. - Phân lập dựa trên những xác định cơ bản ban đầu về hình thái, triệu chứng bệnh và những biểu hiện đặc trưng của. - Tiến hành phân lập khoanh vùng vết bệnh mẫu bệnh và tiến hành soi tươi dưới kính lúp và hiển vi để quan sát mẫu nấm bệnh cần tìm. - Tủ cấy phải được vệ sinh sạch sẽ, chuẩn bị đĩa môi trường PDA tiến hành phân lập. - Sau khi phân lập ủ đĩa ở nhiệt độ từ 25- 28 o C, từ 3-5 ngày. - Nấm được 5 ngày tuổi tiến hành cấy chuyền lần 1, tương tự cấy chuyền lần 2 có được dòng nấm thuần để nuôi bào tử nấm Colletotrichum trên môi trường WA từ 12-24h ủ ở nhiệt độ từ 25 - 28 o C. - Bào tử bắt được cho vào môi trường PDA mới, ủ ở nhiệt độ từ 25 - 28 o C, từ 5-8 ngày. - Nấm sau khi đạt độ già thuần thục chủng nấm lại trên trái qua 3-5 ngày vết bệnh cho thấy giống như vết bệnh được phân lập ban đầu để có kết quả chính xác tiến hành phân lập lại trên môi trường PDA lần nữa. - Tiến hành làm tiêu bản xem bào tử nấm dưới kính hiển vi quang học. - Để quan sát và ghi nhận hình dạng đĩa áp, áp dụng phương pháp nuôi cấy trên lam (Waller et al., 1998). - Chuẩn bị môi trường PCA, lame kính được khử trùng sạch sẽ, đặt một miếng môi trường PCA có đường kính 8 mm và bề dày 3 mm, cấy nấm vào bốn góc của khoanh môi trường PCA và đặt lamela khử trùng lên khối môi trường đã được cấy nấm, sau đó đặt tất cả vào trong đĩa petri có lót giấy thấm được tẩm 2,5 ml nước cất thanh trùng. - Sau 15 ngày chuyển lamella sang một lam khác để quan sát đĩa áp của nấm.. - Cuối cùng tiến hành định danh bằng cách giải trình tự chuỗi gen 28S rRNA và so sánh trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST. - Mục đích phân lập nấm gây bệnh để có được dòng nấm bệnh thuần chủng, tạo sự thuận lợi cho quá trình nghiên cứu khảo sát khả năng ức chế của chitosan trên sự phát triển của nấm thán thư trên xoài Cát Hòa Lộc.. - 2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế nấm. - Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán trên môi trường nuôi cấy PDA. - Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ chitosan và pH tối ưu nhất để ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. - Chọn đĩa nấm thuần sau khi phân lập. - bị môi trường PDA kết hợp với chitosan ở các nồng độ 0,3. - Tiến hành cấy nấm dùng ống kim loại khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và đục lỗ có đường kính 6 mm trên môi trường thạch nấm. - Dùng dao chuyển khoanh khuẩn ty có đường kính 6 mm sang môi trường PDA có dịch chitosan và theo dõi sự phát triển nấm sau 24h và quan sát liên tục trong 10 ngày, đo kích thước của vòng nấm phát triển so với đĩa đối chứng (môi trường PDA không bổ sung chitosan) để xác định nồng độ chitosan và pH tối ưu.. - 2.2.3 Khảo sát khả năng ức chế của chitosan đối với trái bị nhiễm bệnh nhân tạo. - Nghiên cứu nhằm tìm hiểu mức độ phát triển của nấm gây bệnh sau khi được lây nhiễm trực tiếp và khả năng ức chế của chitosan lên trái để có thể ứng dụng trực tiếp trên quy mô thực địa. - Phương pháp 1:cho 15 µl. - Phương pháp 2: Cho 15 µl chitosan 1% vào các vết thương trước để khô trong 1h rồi tiếp tục cho 15 µl huyền phù bào tử lên, làm khô trong 2 h. - Bảo quản ở nhiệt độ phòng, quan sát sau 24h về kích thước sự phát triển của vết bệnh và thời gian ủ bệnh. - Xác định tính gây hại của nấm và khả năng ức chế của chitosan so với trái đối chứng. - Sau 24h nếu nấm phát triển thì sẽ xuất hiện vết màu nâu đen hơi lõm ngay vị trí gây tổn thương và khả năng phát triển nhanh hay chậm tùy thuộc vào khả năng ức chế của chitosan so với trái đối chứng (chỉ cấy nấm không sử dụng chitosan).. - 2.3 Phương pháp xử lý số liệu. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm Colletotrichum gloesporioides từ xoài nhiễm bệnh. - Những triệu chứng cơ bản của nấm Colletotrichum trên trái xoài bệnh là vết bệnh có màu nâu đen, hình tròn và hơi lõm. - Kết quả cho thấy là vẫn thu được vết bệnh giống như ban đầu.. - Đối với nấm Colletotrichum pH tối thiểu có thể phát triển là pH 5. - Đĩa áp có dạng trứng, tròn màu nâu nhạt Các kết quả phân lập và quan sát tiêu bản dưới. - kính hiển vi có thể cho thấy nghiên cứu đã phân lập được nấm Colletotrichum sp. - Để có thể xác định được chính xác hơn, mẫu nấm phân lập được gửi đi giải trình từ gen bằng phương pháp sinh học phân tử.. - Điều này cho phép kết luận là công việc phân lập đã thu được chính xác loài nấm gây bệnh thán thư trên xoài cần nghiên cứu.. - Hình 2: Nấm C.gloesporioides sau 10 ngày tuổi mặt trên và dưới đĩa petri. - Hình 3: Bào tử nấm C. - gloesporioides dạng hình trụ hai đầu cùn có kích thước từ µm (X40) 1a trên trái, 1b từ đĩa nấm sau khi phân lập trên PDA, 1c các gai trong ổ nấm, xem dưới kính hiển vi quang học X 40. - 3.2 Khả năng ức chế nấm C.gloeosporioides gây bệnh thán trên môi trường nuôi cấy PDA.. - Kết quả thử sự phát triển của nấm ở 3 mức pH. - 5,5 trên môi trường PDA được thể hiện ở Hình 4.. - Hình 4: Khả năng phát triển của nấm ở các mức pH 4,5. - 5,5 trên môi trường PDA Từ kết quả cho thấy nấm chỉ phát triển ở pH 5. - và pH 5,5 còn ở pH 4,5 thì nấm không phát triển được.. - chế nấm ở pH được chọn là pH 5 là do chitosan chứ không phải do ảnh hưởng của pH.. - Bảng 1 thể hiện khả năng ức chế nấm C.. - gloeosporioides theo nồng độ chitosan và pH của môi trường. - Khả năng này được xác định thông. - qua đường kính vòng ức chế (cm), đây là hiệu số đường kính của khuẩn ty của mẫu đối chứng so với mẫu có bổ sung chitosan sau thời gian 10 ngày.. - Bảng 1: Sự thay đổi khả năng ức chế nấm C.gloeosporioides tùy thuộc nồng độ chitosan và pH môi trường PDA thể hiện qua đường kính vòng ức chế (cm) pH_nồng độ Đường kính vòng ức chế (cm). - Kết quả ở Bảng 1 cho thấy pH 5 có thể chọn làm pH thích hợp nhất trong việc ức chế nấm trên môi trường PDA + chitosan. - Mặt khác, ở điều kiện pH 5, kết quả ức chế nấm với nồng độ của chitosan 1% và 2% không có khác biệt nhiều. - Bên cạnh đó, kết quả không khác nhiều so với pH =5 và 1% chitosan nên dựa trên kết quả thí nghiệm chọn 1% chitosan ở pH =5 làm kết quả tối ưu nhất cho thí nghiệm ức chế nấm trên môi trường PDA.. - Kết quả thu được này cũng phù hợp với nghiên cứu của Le Thanh Long et al (2013), cho thấy chitosan có khả năng ức chế nấm ở 0,8. - Với kết quả pH=5+1% chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gần như tốt nhất sau khi theo dõi trong 10 ngày thì vòng phát triển nấm là nhỏ nhất 0,96 cm, tương ứng với đường kính vòng ức chế là lớn nhất (8,04 cm) so với mẫu đối chứng (không chứa chitosan, pH 7) là 9 cm, từ kết quả cho thấy rằng hiệu quả của chitosan trong ức chế nấm thán thư trên xoài.. - Hình 5: Khả năng ức chế nấm Colletotrichum ở các nồng độ chitosan và 2 mức pH khác nhau Biểu đồ thể hiện ở mức pH 5 khả năng ức chế. - tốt hơn so với pH 5,5 và các mức nồng độ thì vòng phát triển của nấm to hơn.. - 3.3 Khả năng gây hại của nấm và hiệu quả ức chế của chitosan. - Chitosan 1% được sử dụng ở nghiên cứu này để xem hiệu quả tác dụng chitosan lên trái.. - Kết quả thí nghiệm theo phương pháp 1 được thể hiện ở Hình 6 và Hình 7.. - Hình 6: Trái xoài bị nhiễm bệnh nhân tạo được xử lý chitosan theo phương pháp 1. - Hình 7: Tỉ lệ nhiễm bệnh nấm Colletotrichum trên xoài đã gây tổn thương nhân tạo ở theo phương pháp 1 TLNB: Tỉ lệ nhiễm bệnh. - Hình 8: Trái xoài bị nhiễm bệnh nhân tạo được xử lý chitosan theo phương pháp 2. - Hình 9: Tỉ lệ nhiễm bệnh nấm Colletotrichum trên xoài đã gây tổn thương nhân tạo theo phương pháp 2 TLNB: Tỉ lệ nhiễm bệnh. - Kết quả thí nghiệm theo phương pháp 2 được thể hiện ở Hình 8 và Hình 9.. - Kết quả thí nghiệm trên 2 phương pháp cho thấy rằng, phương pháp 2 giảm khả năng phát triển của nấm xuống gần 40%, ở hai thí nghiệm theo thống kê mẫu đối chứng không thay đổi, riêng mẫu 10 o thì ở phương pháp 1 tỉ lệ nhiễm bệnh lên đến 91,67% còn phương pháp 2 thì chỉ có 66,66% ở mật số cao vi sinh vật cao nhưng nếu sử dụng phương pháp 2 thì vẫn giảm được tỉ lệ nhiễm nấm gây bệnh khoảng 30-40% so với mẫu 10 o ở phương pháp 1. - Còn đối với mẫu 10 -1 thì ở phương pháp 1 là 58,33% phương pháp 2 là 16,66%, mẫu 10 -2 ở phương pháp 1 là 27,78% và phương pháp 2 là 8,33%, kết quả cho thấy màng chitosan bao phủ bên ngoài trái có khả năng hạn chế được sự phát triển của nấm bệnh. - Theo Le Thanh Long et al., (2013) cho thấy chitosan hòa tan trong nước có thể là nguyên nhân làm biến dạng hoặc mỏng hơn vách tế bào của nấm C. - Thêm vào đó, chitosan là thuốc diệt nấm có hiệu quả ngăn cản bào tử nấm nảy mầm, ống mầm kéo dài và sợi nấm phát triển của nấm gây bệnh, như Alternaria solani (Xu et al., 2007), Botrytis cinerea (Xu et al., 2007), Rhizopus stolonifer (Hernandez-Lauzardo et al., 2008), Penicillium (Liu et al., 2007), Phytophthora capsici (Xu et al.,2007) and Sclerotium rolfsii (Eweis et al., 2006).Từ những kết quả trên, nhóm nghiên cứu sẽ tiếp tục thử nghiệm khả năng ức chế của chitosan đối với C.. - gloesporioides phát triển trên xoài được phun xịt tại vườn.. - Ở thí nghiệm này đã khẳng định chitosan có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm C.. - gloesporioides làm giảm khả năng phát triển và ức chế sự mở rộng tổn thương của nấm bệnh, khi bào tử nấm đã được cấy trực tiếp vào thịt trái nên không tiêu diệt hoàn toàn được.. - Kết quả nghiên cứu đã tiến hành sử dụng chitosan ức chế nấm C. - gloesporioides trên môi trường PDA đạt được kết quả tối ưu là pH 5 và nồng độ chitosan 1% có khả năng ức chế nấm tốt nhất. - Khảo sát cũng cho thấy là nồng độ này cũng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh trực tiếp trên trái xoài theo 2 phương pháp xử lý khác nhau là gây nhiễm bằng huyền phù bào tử nấm trước, sau đó mới xử lý và xử lý trước sau đó lây nhiễm bằng dung dịch huyền phù bào tử. - Trong các nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành đánh giá hiệu quả. - của việc phun xịt chitosan trên thực địa đến khả năng ức chế nấm bệnh C. - Dự án phát triển cây ăn quả- Trung nghiên cứu xuất bản sách và tạp chí