- Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (CIP) trong một số dược phẩm bằng phương pháp điện hóa” dưới sự hướng dẫn chỉ bảo của PGS. - 1.3 Một số phương pháp xác định họ quinolone.. - 1.3.1 Phương pháp điện hóa. - 1.5 Xác định CIP bằng phương pháp điện hóa. - 1.5.1 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực rắn. - 1.5.2 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực giọt thủy ngân. - 1.5.3 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực chọn lọc ion. - 1.6 Xác định CIP bằng phương pháp trắc quang. - CHƯƠNG 2 – KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN XÁC ĐỊNH CIP. - 2.2.1 Khảo sát pH. - 2.3.1 Khảo sát thế hấp phụ. - 2.3.2 Khảo sát thời gian hấp phụ. - 2.3.3 Khảo sát thời gian cân bằng. - 2.3.7 Khảo sát thời gian sục khí. - 2.4 Lập đường chuẩn xác định CIP. - CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CIP TRONG MẪU VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Xác định CIP trên mẫu thuốc bằng phương pháp điện hóa. - 64 3.1.2 Xác định CIP trong mẫu thuốc rắn SPM. - 3.1.3 Xác định CIP trong mẫu thuốc rắn Ind. - 69 3.1.4 Xác định CIP trong mẫu thuốc nhỏ mắt ED. - 3.2 Lập đường chuẩn xác định CIP bằng phương pháp trắc quang. - 3.3 Xác định CIP trong mẫu thuốc bằng phương pháp trắc quang. - 3.3.1 Xác định CIP trong mẫu thuốc rắn SPM. - 3.3.2 Xác định CIP trong mẫu thuốc rắn Ind. - 3.3.3 Xác định CIP trong mẫu thuốc nhỏ mắt ED. - 3.4 Kiểm chứng các kết quả xác định CIP bằng hai phương pháp.. - MỞ ĐẦU Ra đời từ những năm 1970, là phương pháp có độ nhạy cao, định lượng được nồng độ các chất trong khoảng từ M phương pháp điện hóa hòa tan xác định được rất nhiều các kim loại và đặc biệt có thể xác định cùng lúc nhiều chất mà không phải tiến hành tách hay che. - Quá trình này ứng dụng rất thành công trong việc định lượng lại các loại thuốc, dược phẩm từ đó mở rộng vào việc xác định các mẫu sinh học của người, quá trình xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm.. - Tính đến những năm 70 người ta đã xác định rất nhiều các loại dược phẩm khác nhau chứa nhóm sunfonamide và nitro, các loại này thuộc hơn 10 nhóm khác nhau đã được thống kê [24]. - Trên cơ sở xác định CIP trên mẫu thuốc bằng phương pháp điện hóa từ đó có thể mở rộng xác định CIP trong các mẫu huyết tương, nước tiểu, máu của người dùng thuốc.. - Chính vì những lí do đó mà tôi chọn đề tài nghiên cứu của mình là: Nghiên cứu xác định Ciproflxacin (CIP) trong một số dược phẩm bằng phương pháp điện hóa. - Trong đề tài này, tôi sử dụng phương pháp vol – ampe hòa tan hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân treo, kĩ thuật quét sóng vuông để xác định CIP trong nền đệm axetat ở pH=4. - Họ quinolone là họ thuốc kháng sinh liều cao dùng để điều trị các bệnh đặc hiệu do đó họ thuốc này tương đối phổ biến hiện nay, có nhiều phương pháp định lượng lại các loại thuốc cũng như xác định sự đào thải các hợp chất này qua các mẫu sinh học.. - 1.3.1 Phương pháp điện hóa Do có ba N trong phân tử nên các hợp chất thuộc họ quinolone xác định được bằng các phương pháp điện hóa nhờ sóng xúc tác hiđro. - Người ta không xác định được rõ ràng là N nào tham gia vào quá trình nhận H+ nhờ đôi e tự do trên N nhưng vị trí các peak thường trong khoảng 1,4 – 1,5V cho thấy quá trình này là sóng xúc tác H. - Tuy có nhiều phương pháp xác định nồng độ các quinolones ở các lượng vết rất nhỏ nhưng phương pháp điện hóa với sự kế thừa của phương pháp cực phổ từ những năm 1990 và kĩ thuật xung vi phân vẫn ngày càng phát triển và được ứng dụng nhiều đặc biệt là trong lĩnh vực định lượng thuốc. - Từ giữa những năm 90 thì bắt đầu xuất hiện các nghiên cứu về quinolones mà mở đầu là xác định norfloxacin bằng phương pháp cực phổ trực tiếp và kĩ thuật xung vi phân. - Tiếp theo đó cũng theo [31] nghiên cứu peak khử của ofloxacin xuất hiện ở thế -1,343V theo phương pháp quét điện hóa tuyến tính với điện cực so sánh SCE trong đệm vạn năng pH = 4 cho thấy quá trình khử của ofloxacin là quá trình bất thuận nghịch cho khoảng xác định tuyến tính từ 8.10-4 M đến 5.10-2 M với giới hạn phát hiện là 4.10-6 M. - Xác định ofloxacin trong các mẫu dung dịch chuẩn của nó, mẫu thuốc và các chất lỏng sinh học các tác giả tìm được khoảng tuyến tính của ofloxacin từ 4.10-5 đến 5.10-4M trong nền đệm axetat pH = 5 kĩ thuật xung vi phân.. - Các tác giả [31] cũng nói đến qui trình xác định norfloxacin trên điện cực glassy cacbon sử dụng kĩ thuật von – ampe vòng và kĩ thuật sóng vuông, peak của norfloxacin cho khoảng tuyến tính từ 5-50 ppm với giới hạn phát hiện là 1,1 ppm. - Norfloxacin đã được xác định trong các mẫu thuốc trước đó bằng phương pháp cực phổ cổ điển [16]. - Điện cực hỗn hống bạc được sử dụng để làm hệ chỉ thị cho phương pháp, mỗi lần xem xét sự thay đổi của 0,5(A/ml và sử dụng chất chuẩn là dung dịch Fe(III) 0,097M, phương pháp xác định được nồng độ CIP thấp ở mức 4ppm.. - Dựa trên một nghiên cứu trước đó là xác định hàm lượng enrofloxacin trong mẫu thuốc và nước tiểu của chó bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ kĩ thuật xung vi phân [15] nhưng tiến hành trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh cho hai khoảng tuyến tính là 4-15 và 18 – 55 ng/ml với thời gian hấp phụ 180s và 60s ở thế hấp phụ -0,3V. - Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố xuất hiện peak, nồng độ đồng và pH các tác giả tìm được điều kiện tối ưu để xác định enrofloxacin với khoảng tuyến tính là 10 – 80 nM, giới hạn phát hiện là 0,33nM.. - Xác định levofloxacin trong nước tiểu người bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ trên anot kĩ thuật quét sóng vuông trên điện cực glassy cacbon. - Theo tài liệu [17] nghiên cứu sự xuất hiện peak của levofloxacin trong đệm axetat pH = 5 với kĩ thuật quét sóng vuông và von-ampe vòng các tác giả đã xác định được peak oxi hóa của levofloxacin xuất hiện ở thế 0,4V với điện cực so sánh là Ag/AgCl, khoảng tuyến tính xác định được là 6.10-9M đến 5.10-7M với giới hạn phát hiện là 5.10-9M. - Nghiên cứu cũng tiến hành xác định các mẫu bằng phương pháp HPLC để đối chứng, kết quả cho thấy phương pháp đã dùng để xác định levofloxacin trong mẫu nước tiểu hoàn toàn tin tưởng được. - Xác định pefloxacin trong thuốc viên nén và huyết thanh bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ catốt kĩ thuật quét sóng vuông. - Theo tác giả tài liệu [12] tiến hành đo peak khử của pefloxacin trong dung dịch đệm vạn năng (đệm Britton - Robinson) pH = 7 trên điện cực giọt thủy ngân treo xác định được peak xuất hiện ở thế -1,07V với điện cực so sánh là Ag/AgCl, thế hấp phụ -0,4V. - Tài liệu [27] tóm tắt cách xác định một số quinolones bằng phương pháp điện hóa theo bảng sau: Chất. - Phương pháp. - Các quinolones xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính tuân theo định luật Lambert – Beer từ 3-10 ppm, nhiều phổ màu của nhóm quinolones được xác định dựa vào phản ứng tạo phức với sắt (III). - Dưới đây là bảng tóm tắt kết quả xác định một số quinolones bằng phương pháp trắc quang: Chất. - Phản ứng tạo phức với sắt (III), phổ hấp thụ quang xác định ở 447 nm. - Phản ứng tạo phức với sắt (III), phổ hấp thụ quang xác định ở 430 nm. - Các tác giả [33] nghiên cứu xác định đồng thời ba chất ciprofloxacin, enrofloxacin và pefloxacin thông qua phản ứng tạo phức trao đổi điện tích với ba tác nhân nhận khác nhau. - 520nm, phương pháp này xác định được hàm lượng các chất CIP trong dạng viên nén, enrofloxacin trong thuốc dạng dung dịch tan và pefloxacin ở dạng dung dịch tiêm với độ chính xác lần lượt là . - 460nm, phương pháp xác định được pefloxacin ở dạng thuốc nén và dung dịch tiêm với độ chính xác là và . - 1.3.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Theo [29] HPLC có ưu điểm rõ rệt là xác định được nồng độ chất ở nồng độ rất nhỏ đối với họ quinolones, phương pháp triết pha rắn cho khả năng xác định đến nồng độ cỡ 100pg/ml còn phương pháp HPLC xác định được đến nồng độ 2ng/ml. - Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nhiều công nghệ xác định CIP ở các đối tượng khác nhau như các dung dịch lỏng trong cơ thể, huyết thanh, các mô động vật, thậm chí cả ở huyết tương. - Phương pháp này còn phát triển xác định được các fluoroquinolones trong các vật liệu sinh học bao gồm. - Tài liệu [32] xác định đồng thời ba chất ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin trong tóc người bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 và detector nhạy fluorescence kết hợp với kĩ thuật triết pha rắn các loại thuốc từ dung dịch hòa tan tóc trong NaOH1M. - Phương pháp này xác định được hàm lượng các loại thuốc trong khoảng từ 0,3-100ng/ml. - Các tác giả [35] sử dụng phương pháp sắc kí (HPLC) để xác định hàm lượng của ofloxacin trong mẫu huyết thanh, sử dụng các chất hấp phụ khác nhau như: ODS, C8, C1, CN, phenyl and tert.-butyl và mẫu huyết thanh sau khi đã được lọc bằng màng Molcut II để loại bỏ protein, phần nước lọc được làm giàu trên cột với pha tĩnh phenyl sau đó được dẫn đến cột phân tích với pha tĩnh là ODS. - Ofloxacin và enoxacin được xác định bằng detector UV ở bước sóng. - Phương pháp cho phép xác định nồng độ của ofloxacin trong khoảng từ 50 – 2000 ng/ml, giới hạn phát hiện là 20 ng/ml. - Hơn nữa, nhiều ion kim loại được khử trên điện cực Hg mà không tạo hỗn hống với Hg cũng được xác định bằng phương pháp này. - Hơn 200 hợp chất hữu cơ bao gồm một lượng lớn các chất sinh học, dược phẩm và một số ion có khả năng tạo phức với các phối tử hữu cơ đã được xác định bằng phương pháp này. - Do đó cần phải tối ưu hóa các điều kiện xác định để thu được tín hiệu cao nhất. - Ví dụ: đimetylglyoxime được trộn vào điện cực than cácbon để xác định niken trong các môi trường phức tạp. - Có thể xác định lượng tối thiểu 1,5 (g/ml trong mẫu. - Sự xác định các loại hợp chất này trong mẫu nước tiểu và huyết tương không cần xử lý sơ bộ, nhưng với điện cực được mạ lớp màng Spectrapor để trách được sai số do điện cực vì khả năng hấp phụ các protein. - Một hướng quan tâm lớn là xác định các loại thuốc chống ung thư. - Phương pháp phân tích nhanh (khoảng 10ph) cho phép xác định hàm lượng thuốc trong mẫu nước tiểu từ bệnh nhân bị ung thư. - Người ta chứng tỏ được rằng methotrexate có thể được xác định trực tiếp trong nước tiểu sau khi pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:4 cùng với chất điện phân nền. - Trường hợp này sử dụng điện cực HMDE nhưng trước khi xác định mẫu huyết thanh cần phải chiết trước, 5-fluorouracil có thể xác định được mà không bị ảnh hưởng bởi axit ascorbic (vitamin C) và axit uric thường xuyên có mặt trong mẫu sinh học.. - 1.5 Xác định CIP bằng phương pháp điện hóa 1.5.1 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực rắn Tài liệu [30] xác định CIP cùng 5-aminosalixylic axit và azithromycin trong dung dịch rắn dạng vi tinh thể, dùng phương pháp von-ampe xác định vi tinh thể tĩnh là phương pháp dùng chủ yếu trong định lượng quặng, hợp kim và các chất tan hữu cơ đơn giản. - 5-Aminosalixylic axit là hoạt chất dùng trong điều trị chứng viêm ruột, đại tràng, nó bị oxi hóa thành dạng quinone-imine trên điện cực cacbon, phản ứng này chính là cơ sở để xác định hợp chất trên trong thuốc và các mẫu sinh lý. - Các vi hạt rắn của ba loại chất trên là quá trình động học tĩnh trên điện cực cacbon đã được thấm parafin, khi nghiên cứu quá trình này bằng kĩ thuật quét sóng vuông và kĩ thuật von-ampe vòng để xác định hàm lượng của chúng, các tác giả đã xác định được 5-aminosalixylic axit bị oxi hóa ở 0,54V với phản ứng là thuận nghịch trên điện cực, trong khi CIP và azithromycin bị oxi hóa ở 1,2V và 0,94V, hai quá trình này đều bất thuận nghịch.. - vàng lên bề mặt phim phát điện làm bằng poly(pyrrole-NHS) người ta xác định được lượng vết CIP với nồng độ thấp tới 10pg/ml. - Phương pháp điện hóa còn ứng dụng trong việc xác định độ hấp thụ của thuốc đối với quá trình trao đổi chất trong cơ thể. - Tài liệu [20] dựa trên việc nghiên cứu phản ứng của CIP với DNA thông qua độ nhạy điện hóa của DNA, các tác giả xác định được hàm lượng của CIP trong khoảng nồng độ từ 40 – 80 (M bằng phương pháp xung vi phân trong nền đệm axetat 0,2M pH = 5 trên điện cực glassy cacbon nhận dạng DNA, phương pháp cho peak oxi hóa ở vị trí +0,9V, giới hạn phát hiện đạt 24(M.. - 1.5.2 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực giọt thủy ngân Các chất ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin với sự hỗ trợ của chemometric còn xác định được đồng thời trong cùng hỗn hợp bằng phương pháp von-ampe hấp thụ kĩ thuật xung vi phân trong nền đệm vạn năng (đệm Britton–Robinson) ở pH = 3,78 trên điện cực giọt thủy ngân treo. - Theo [36] từ những năm 90 kĩ thuật cực phổ xung vi phân đã cho phép xác định CIP trong nền đệm vạn năng ở pH = 8,5, phương pháp cho hai peak ở thế -1,44 và -1,64V, xác định CIP ở nồng độ 6.10-7 đến 3.10-5M trong các mẫu thuốc với độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,4%.. - 1.5.3 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực chọn lọc ion Theo [21] dựa trên việc chế tạo điện cực chọn lọc ion đối với CIP: phủ một lớp bạc kim loại lên bản phim làm bằng chất dẻo PVC các tác giả đã xác định được hàm lượng CIP rất thành công trong các mẫu dược phẩm và dung dịch chuẩn của nó nhờ phương pháp thêm chuẩn. - 1.6 Xác định CIP bằng phương pháp trắc quang Phương pháp trắc quang xác định CIP đã được nghiên cứu rất nhiều trong các tài liệu, theo [33] CIP được xác định thông qua phản ứng tạo phức trao đổi điện tích với nhiều hợp chất như tetrachlorobenzoquinone, p-benzoquinone, p-nitrophenol, 2,3-dichloro-5,6-dicyano-p-benzoquinone, p-chloranil, tetracyanoquinodimethane và phản ứng tạo phức qua cặp ion với các chất bromocrezol hồng và bromophenol xanh, metyl da cam, bromothylmol xanh.. - Nghiên cứu xác định dung dịch cân bằng giữa ion sắt (III) và CIP trong môi trường ion NO3- và môi trường mixen. - Công thức phức một điện tích dương của CIP xác định được bằng thực nghiệm là Fe(cipx)2+, Fe(cipx)2+ and Fe(OH)cipx.. - Dựa trên phản ứng tạo phức của CIP và norfloxacin với sắt (III) trong môi trường axit sunfuric, các tác giả đo được độ hấp thụ quang cực đại của hai phức này lần lượt ở các bước sóng là 447 và 430nm, tỉ lệ giữa ion sắt (III) và CIP là 1:2 trong phức tạo thành với nồng độ H2SO4 là 5.10-3M, phương pháp nghiên cứu được cho phép xác định hàm lượng các chất trên trong khoảng nồng độ tương ứng là 50 – 500 ppm và 50 – 400 ppm đối với CIP và norfloxacin. - Xác định CIP bằng phổ VIS thông qua phản ứng tạo phức với sắt (III) nitrat. - Theo tài liệu [25] xác định CIP trong thuốc dạng viên nén và thuốc lỏng thông qua phản ứng tạo phức giữa CIP với thuốc thử Fe(NO3)3 1% trong HNO3 1%, phức thu được có màu vàng da cam được xác định bằng phổ VIS ở bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại là 435nm và bền trong 60s. - Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert – Beer là 20 – 100 ppm, phương pháp xác định được chính xác hàm lượng CIP trong các vật liệu thô và các loại thuốc thương mại cả dạng viên nén và dạng dung dịch lỏng.. - 2.1.2.1 Phương pháp von-ampe vòng Để nghiên cứu tính chất điện hóa của CIP cụ thể là tính thuận nghịch của phản ứng khử CIP trên catôt và tìm điều kiện cho sự xác định bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan ta tiến hành phương pháp von-ampe vòng trên điện cực giọt thủy ngân.. - Sau khi lựa chọn được kĩ thuật đo tiến hành khảo sát pH tối ưu cho quá trình xác định CIP, tiến hành khảo sát các pH trong khoảng bằng đệm vạn năng. - Do đó khảo sát tiếp với các loại đệm khác để xác định loại đệm phù hợp nhất với CIP.. - Hình 8: Khảo sát peak của CIP ở nồng độ. - Bảng 8: Khảo sát sự phụ thuộc chiều cao peak của CIP vào thời gian hấp phụ. - 2.4 Đường chuẩn xác định CIP Như vậy quá trình khảo sát ở trên chúng tôi tóm tắt lại điều kiện tối ưu nhất để xác định CIP bằng phương pháp điện hóa là: Xác định CIP bằng phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ kĩ thuật sóng vuông trong nền axetat 0,075M pH = 3,8. - Các điều kiện này được sử dụng để lập đường chuẩn xác định CIP và xác định CIP trong mẫu cần định lượng. - Trước hết để xác định khoảng tuyến tính của CIP, sử dụng mẫu CIP chuẩn xác định trong các điều kiện trên trong khoảng nồng độ từ 0,01ppm đến 0,26 ppm thu được các kết quả như sau: