- NHẬN DIỆN VÀ XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA HAI CÁ THỂ QUÝT ĐƯỜNG KHÔNG HỘT ĐƯỢC. - Để có thông tin về đặc điểm di truyền của hai cây quýt Đường không hột được phát hiện ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Nguyễn Bảo Vệ et al., 2007), đề tài được thực hiện nhằm:. - (i) tìm phương pháp đánh dấu phân tử để nhận diện và (ii) xác định mối quan hệ di truyền giữa hai cây quýt Đường không hột với nhau và với cây quýt Đường có hột. - Kết quả giải trình tự các nucleotide vùng ITS và gen matK cho thấy giữa hai cây quýt Đường không hột là giống nhau và không khác biệt với cây quýt Đường có hột. - Sự kiện các nhà khoa học Trường Đại học Cần Thơ phát hiện được hai cây quýt Đường cho trái hoàn toàn không hột ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) (Nguyễn Bảo Vệ et al., 2007), là một tín hiệu vui cho sản xuất nông nghiệp nói chung và sự phát triển nghề trồng cam quýt ở nước ta nói riêng vì quýt Đường là loại trái ngon, loại cây có giá trị kinh tế cao, được trồng nhiều ở ĐBSCL, nhưng giống trồng phổ biến hiện nay còn khá nhiều hột, gây khó khăn trong việc chế biến và làm giảm giá trị sản phẩm. - Tính trạng không hột thường do kiểu gen hoặc do điều kiện môi trường chi phối (vì cây cam quýt có khả năng trinh quả sinh), vì vậy để có cơ sở phát triển giống quýt Đường không hột vừa được phát hiện vào sản xuất, đồng thời với nhiều nghiên cứu được tiến hành như khảo sát đặc tính hình thái thực vật, sự ổn định của tính trạng không hột. - Việc bước đầu tìm hiểu thông tin về đặc điểm di truyền của hai cây quýt Đường không hột này cần được thực hiện nhằm: (i) tìm phương pháp đánh dấu phân tử để nhận diện và (ii) xác định mối quan hệ di truyền giữa hai cây quýt Đường không hột với nhau và với cây quýt Đường có hột dựa trên kết quả phân tích trình tự các nucleotide vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) trong nhân và gen matK (maturase matK) trong lục lạp kết hợp với kỹ thuật RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA).. - Mẫu lá cây quýt Đường không hột mã số 1, cây quýt Đường không hột mã số 80 và cây quýt Đường có hột bình thường mã số 63 (Nguyễn Bảo Vệ et al., 2007) có cùng tuổi trồng (được trồng năm 2001), cùng điều kiện canh tác, không sâu bệnh tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp được thu thập để điện di.. - Hình 1: Phổ điện di DNA của lá cây quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1, 2 và 3), cây quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 4, 5 và 6) và cây quýt Đường có hột mã số 63. - Nồng độ trung bình các mẫu DNA quýt Đường không hột và có hột khoảng 245 ng/μl.. - Bảng 1: Nồng độ các mẫu DNA của quýt Đường không hột và có hột Cây quýt Đường abs. - 260 nm Axit nucleic (ng/μl) Không hột mã số 1. - Không hột mã số 80 Có hột mã số 63. - Phân tích các sản phẩm khuếch đại. - Kết quả phân tích mẫu lá của hai cây quýt Đường không hột và cây quýt Đường có hột được trình bày ở hình 2 và hình 3.. - Kết quả phân tích vùng ITS cho thấy trình tự các nucleotide giữa hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột đều không có sự khác biệt nhau (Hình 4) và đều có tỷ lệ Guanin (G = 31,6%) và Cytosine (C = 33,3%) cao hơn tỷ lệ Adenine (A = 20,2%) và Thymine (T = 14,8%) hay nói một cách khác là đều có thành phần GC (65%) cao hơn thành phần AT (35%).. - Hình 4: Một đoạn so sánh trình tự nucleotide của vùng ITS trên quýt Đường không hột và có hột. - 1: quýt Đường không hột mã số 1. - 2: quýt Đường không hột mã số 80. - và 3: quýt Đường có hột mã số 63.. - Theo kết quả Blast (Basic Local Alignmet Search Tool) trong NCBI (National Center for Biotechnology Information), sự tương đồng của trình tự các nucleotid vùng ITS ở hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột này với các nghiên cứu khác trên Citrus spp. - Hình 2: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 2) và quýt Đường có. - hột mã số 63 (giếng 3) so với thang chuẩn 1 kb (giếng M). - Hình 3: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi matK-390F/matK-1326R trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 2) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng. - Bảng 2: Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng ITS của hai cây quýt Đường không hột và cây quýt Đường có hột trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). - Kết quả phân tích gen matK cho thấy trình tự các nucleotide giữa hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột đều không có sự khác biệt (Hình 5) và đều có tỷ lệ Adenine (A = 27,2%) và Thymine (T = 35,4%) cao hơn tỷ lệ Guanin (G = 17,5%) và Cytosine (C = 19,8%) hay nói một cách khác là đều có thành phần AT (62,7%) cao hơn thành phần GC (37,3%).. - Hình 5: Một đoạn so sánh trình tự nucleotide của gen matK trên quýt Đường không hột và có hột. - Theo kết quả Blast trong NCBI, sự tương đồng của trình tự các nucleotid gen matK ở hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột này với các nghiên cứu khác trên Citrus spp. - Bảng 3: Kết quả Blast trình tự các nucleotid gen matK của hai cây quýt Đường không hột và cây quýt Đường có hột trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). - Sản phẩm khuếch đại. - phân tử (bp) 1. - Trong đó, dễ dàng nhận ra sự khác nhau giữa hai cây quýt Đường không hột (giếng 1 và 2) với cây quýt Đường có hột (giếng 3). - Cây quýt Đường có hột cho sản phẩm khuếch đại đoạn DNA ở hai vị trí 650 bp và 750 bp (ký hiệu a và b) trong khi hai cây quýt Đường không hột không cho sản phẩm khuếch ở những vị trí này. - Qua đó, có thể sử dụng đoạn mồi này để phân biệt các cá thể quýt Đường không hột với cá thể quýt Đường có hột.. - Hình 6: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi A13 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 2) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng. - Đoạn mồi OPH13 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu bảy đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 620 bp đến 1.440 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 7 - giếng 1, 2 và 3). - Các mẫu phân tích đều cho sản phẩm khuếch đại giống nhau. - Do đó, đoạn mồi này không thể nhận biết được các cá thể quýt Đường không hột với cá thể quýt Đường có hột.. - Đoạn mồi SO15 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu mười đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 500 bp đến 1.440 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 7 - giếng 4, 5 và 6). - Các mẫu phân tích đều thể hiện sự đa hình và dễ dàng nhận ra sự khác nhau giữa hai cây quýt Đường không hột (giếng 4 và 5) với cây quýt Đường có hột (giếng 6). - Cây quýt Đường có hột cho sản phẩm khuếch đại đoạn DNA ở vị trí có kích thước phân tử 650 bp (ký hiệu c), trong khi hai cây quýt Đường không hột không cho sản phẩm khuếch đại đoạn DNA ở vị trí này. - Đoạn mồi SN20 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu bảy đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 520 bp đến 2000 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 7 - giếng 7, 8 và 9). - Các mẫu phân tích đều thể hiện sự đa hình và dễ dàng nhận ra sự khác nhau ở cả ba cây quýt Đường phân tích. - Cây quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 7) chỉ khuếch đại đoạn DNA ở ba vị trí có kích thước phân tử lần lượt là 560 bp, 590 bp và 620 bp. - trong khi cây quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 8) có thêm hai vị trí có kích thước phân tử là 1.000 bp và 1.220 bp (ký hiệu f và g). - Cây quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 9) ngoài hai vị trí trên còn có thêm hai vị trí khác có kích thước phân tử là 750 bp và 850 bp (ký hiệu d và e). - Trên cơ sở đó, có thể sử dụng đoạn mồi SN20 để nhận diện hai cá thể quýt Đường không hột với nhau và với cá thể quýt Đường có hột.. - Hình 7: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPH13 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 2) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 3). - mồi SO15 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 4), quýt Đường không. - hột mã số 80 (giếng 5) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 6). - mồi SN20 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 7), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 8) và quýt. - Đường có hột mã số 63 (giếng 9) so với thang chuẩn 1 kb (giếng M). - Đoạn mồi A02 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu năm đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 750 bp đến 1.500 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 8 - giếng 1, 2 và 3). - Tương tự, đoạn mồi OPH18 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu bốn đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 600 bp đến 850 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 8 - giếng 4, 5 và 6). - Hình 8: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi A02 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 1), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 2) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 3). - mồi OPH18 trên quýt Đường không hột mã số 1 (giếng 4), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 5) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 6). - Đường không hột mã số 1 (giếng 7), quýt Đường không hột mã số 80 (giếng 8) và quýt Đường có hột mã số 63 (giếng 9) so với thang chuẩn 1 kb (giếng M). - Đoạn mồi SN06 cho sản phẩm khuếch đại tối thiểu bảy đoạn DNA có kích thước phân tử trong khoảng 500 bp đến 1.000 bp với thang chuẩn 1 kb (Hình 8 - giếng 7, 8 và 9). - Cây quýt Đường không hột 1 (giếng 7) chỉ khuếch đại đoạn DNA ở bốn vị trí có kích thước phân tử lần lượt là 500 bp, 530 bp, 850 bp, 950 bp và 1.000 bp, trong khi cây quýt Đường không hột 2 (giếng 8). - Cây quýt Đường có hột 3 (giếng 9) ngoài vị trí trên còn có thêm một vị trí khuếch đại khác có kích thước phân tử là 750 bp (ký hiệu i). - Trên cơ sở đó, có thể sử dụng đoạn mồi SN06 để nhận diện hai cá thể quýt Đường không hột với nhau và với cá thể quýt Đường có hột.. - Mồi SO15 và A13 có thể phân biệt được hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột. - Trong khi đó, mồi SN06 và SN20 có thể phân biệt được hai cây quýt Đường không hột với nhau và với cây quýt Đường có hột (phân biệt được cả ba cây với nhau).. - Bảng 5: Vị trí băng DNA của sản phẩm PCR-RAPD với các mồi OPH13, SO15, SN20, A02, OPH18, SN06 và A13 của quýt Đường không hột và có hột. - OPH13 SO15 SN20 A02 OPH18 SN06 A13 Cây quýt Đường. - Bằng việc sử dụng kỹ thuật này, chúng tôi đã phát hiện có những sai khác về phổ băng DNA giữa hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột. - Các số liệu thu được về phổ băng DNA của 2 cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột trên đây là những dẫn liệu bổ sung. - Mối quan hệ di truyền giữa hai cây quýt Đường không hột và cây quýt đường có hột được phân tích theo giản đồ nhánh (Hình 9).. - Hình 9: Giản đồ nhánh của hai cây quýt Đường không hột và cây quýt Đường có hột 1: quýt Đường không hột mã số 1. - Qua giản đồ cho thấy cả ba cây quýt Đường nghiên cứu hợp thành một nhánh chính. - Nhánh chính bao gồm cây quýt Đường có hột mả số 63 với hai cây quýt Đường không hột mã số 1 và cây quýt Đường không hột mã số 80 với hệ số giống nhau khá cao (0,87). - Điều này có thể kết luận rằng giữa hai cây quýt Đường không hột với cây quýt Đường có hột có quan hệ di truyền gần nhau.. - Cũng qua giản đồ nhánh cho thấy hai cây quýt Đường không hột hợp thành một nhánh phụ và chúng có hệ số giống nhau cao (0,92). - Điều này có thể kết luận giữa hai cây quýt Đường không hột có quan hệ di truyền gần gũi với nhau.. - Kết quả giải trình tự các nucleotide vùng ITS và gen matK cho thấy giữa 2 cá thể quýt Đường không hột là giống nhau và không khác biệt với cây quýt Đường có hột.. - Bằng kỹ thuật RAPD, đã ghi nhận có những sai khác về phổ băng DNA giữa 2 cây quýt Đường không hột với nhau và với cây quýt Đường có hột. - Đây là dấu phân tử để nhận diện 2 dòng quýt Đường không hột được phát hiện ở ĐBSCL. - Trong khi đó, mồi SN06 và SN20 có thể phân biệt được hai cây quýt Đường không hột với nhau và với cây quýt Đường có hột (phân biệt được cả ba cây với nhau). - Kết quả phân tích quan hệ di truyền cũng cho phép kết luận hai cá thể quýt Đường không hột có mối quan hệ gần gũi với nhau và gần với quýt Đường có hột thương phẩm trong vùng.. - Ứng dụng công nghệ cao trong chọn, tạo giống cam Sành (Citrus nobilis Lour) và quýt Đường (Citrus reticulata Blanco) không hột có năng suất và phẩm chất cao