- Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân là liệu pháp điều trị kết hợp an toàn và hiệu quả cho nhiều loại ung thư, trong đó có ung thư phổi. - Mục tiêu của nghiên cứu là áp dụng quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào NK trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. - Lựa chọn vào nghiên cứu 5 người khỏe mạnh và 5 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, thu thập 10ml máu ngoại vi mỗi người, tiến hành tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, định danh tế bào miễn dịch. - Kết quả: nhóm khỏe mạnh, số tế bào ngày đầu x 106, tỷ lệ sống . - Số tế bào sau 21 ngày nuôi là x 108, tỷ lệ sống trong đó, NK số lượng NK tăng sinh lần. - Nhóm bệnh nhân, số tế bào ngày đầu x 106, tỷ lệ sống . - Số tế bào sau 21 ngày nuôi x 108, tỷ lệ sống trong đó, NK . - 2 Theo phân loại mô bệnh học, ung thư phổi chia làm 2 loại: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không tế bào nhỏ. - Hiện nay trên thế giới, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân được phát triển để điều trị nhiều loại ung thư đã cho những kết quả ban đầu hứa hẹn. - 6 Điều này là lợi thế của tế bào NK so với tế bào T, do đó hấp dẫn các nghiên cứu trên thế giới về phát triển liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân NK để điều trị nhiều loại ung thư, trong đó có ung thư. - phương pháp nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào NK đã làm chậm quá trình phát triển các thử nghiệm lâm sàng pha I truyền tế bào NK cho bệnh nhân ung thư. - Hiện tại, Việt Nam vẫn đang trong giai đoạn tiếp cận với liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân trong điều trị ung thư và chưa có nhiều công trình nghiên cứu được công bố trong lĩnh vực này. - Do đó, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào NK trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. - Các bệnh nhân có bệnh lý tự miễn, dùng thuốc ức chế miễn dịch, bệnh lý mạn tính kết hợp, bệnh lý ảnh hưởng đến các tế bào cơ quan tạo máu sẽ bị loại trừ khỏi nghiên cứu này.. - Kỹ thuật phân tách tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi (PBMC: peripheral blood mononuclear cell): các tế bào miễn dịch được tách bằng phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll 1.077.. - Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào NK: sau khi phân lập, các tế bào được hoạt hóa trong môi trường AIM-V chứa 10% huyết thanh của bệnh nhân, có bổ sung thêm cytokine IL- 2, IL-12, IL-18 theo nồng độ thích hợp trong 7 ngày đầu. - Sau đó, các tế bào sẽ chuyển sang giai đoạn nuôi cấy tăng sinh số lượng lớn. - Tổng thời gian nuôi cấy tế bào NK là 21 ngày.. - Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống, sử dụng Trypan blue: tế bào sau khi phân lập từ máu ngoại vi và sau nuôi cấy được nhuộm với Trypan blue để đếm số lượng và xác định tỷ lệ tế bào sống.. - Dựa trên các marker bề mặt có thể định danh được từng loại tế bào miễn dịch:. - tế bào NK (CD45 + CD3 - CD16+CD56. - tế bào NK-T (CD45 + CD3 + CD16+CD56. - Số lượng tế bào và tỷ lệ tế bào sống sau tách chiết từ máu ngoại vi và sau 21 ngày nuôi cấy ở người khỏe mạnh và bệnh nhân UTPKTBN,. - 2021 tỷ lệ tế bào lympho T, NK-T, NK trong quần thể. - tế bào sau tách chiết từ máu ngoại vi và sau 21 ngày nuôi cấy ở người khỏe mạnh và bệnh nhân UTPKTBN, số lượng tế bào NK sau tách chiết từ máu ngoại vi và sau 21 ngày nuôi cấy ở người khỏe mạnh và bệnh nhân UTPKTBN, sự tăng sinh số lượng tế bào NK sau 21 ngày nuôi cấy ở người khỏe mạnh và bệnh nhân UTPKTBN.. - “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi” đã được Hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà Nội đồng ý thông qua giai đoạn thử nghiệm trên người tình nguyện khoẻ mạnh và bệnh nhân ung thư.. - Số lượng tế bào sau tách từ 10ml máu ngoại vi trung bình là x 10 6 tế bào. - Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, trung bình là bảng 1).. - TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Quần thể tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi người khỏe mạnh, chiếm ưu thế là tế bào lympho T, tỷ lệ trung bình là . - Tỷ lệ tế bào NK và NK-T lần lượt là . - 3,07 Số lượng tế bào thu được sau 21 ngày nuôi cấy là x 10 9 tế bào với tỷ lệ tế bào sống trung bình đạt bảng 1).. - Trong quần thể tế bào thu được, tế bào NK tiếp theo T là NK-T bảng 2). - Số lượng tế bào NK tăng sinh trung bình sau 21 ngày nuôi cấy là lần (bảng 3).. - Số lượng tế bào tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân UTPKTBN trung bình là x 10 6 với tỷ lệ sống là . - Không có sự khác biệt về số lượng tế bào tách được từ máu ngoại vi và tỷ lệ tế bào sống giữa nhóm người khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân (tương ứng với p lần lượt là 0,058 và 0,248) (bảng 1).. - Quần thể tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân, chiếm ưu thế là tế bào lympho T, tỷ lệ trung bình là . - Tỷ lệ tế bào NK và NK-T lần lượt là và bảng 2, hình 1).. - Số lượng tế bào thu được sau 21 ngày nuôi cấy và hoạt hóa là x 10 8 tế bào và tỷ lệ tế bào sống trung bình không có sự khác biệt số lượng tế bào và tỷ lệ tế bào sống với nhóm khỏe mạnh (lần lượt tương ứng p=0,196, p=0,508 (bảng 1).. - Trong quần thể tế bào thu được, tế bào NK tiếp theo là tỷ lệ T tế bào NK- T bảng 2, hình 1). - Số lượng tế bào NK tăng sinh trung bình lần, không có sự khác biệt so với nhóm người khỏe mạnh (p=0,878) (bảng 3).. - Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở người tình nguyện khỏe mạnh trung bình là x10 6 tế bào. - Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, với tỷ lệ sống trung bình đạt 93,6±1,52%. - Kết quả này tương tự như các kết quả trong các nghiên cứu khác với số lượng tế bào thu được sau khi tách chiết từ 10 mL máu ngoại vi người khỏe mạnh là 1,16-1,58x10 6 tế bào/ml và tỷ lệ tế bào sống trung bình khoảng 94,5±1,7%. - 9 Kết quả trên đã đạt yêu cầu chất lượng tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi người bình thường: Số lượng ≥ 5x10 6 tế bào, tỷ lệ sống ≥ 90%, đảm bảo yêu cầu cho giai đoạn nuôi cấy hoạt hóa tiếp theo.. - Quần thể tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi người tình nguyện khỏe mạnh gồm các tế bào miễn dịch nhiều nhất là lympho T, tỷ lệ trung bình là tiếp theo lympho B là tế bào NK là bạch cầu mono và đa nhân trung tính lần lượt là và . - Kết quả có tỷ lệ B, NK, mono tương đồng và tỷ lệ tế bào T thấp hơn so với nghiên cứu của Hendrika W. - S ố lượ ng t ế bào thu đượ c sau 21 ngày nuôi c ấ y và ho ạ t hóa là x 10 8 t ế bào và t ỷ l ệ t ế bào sống trung bình không có sự khác biệt số lượng tế bào và tỷ lệ tế bào sống với nhóm khỏe mạnh (lần lượt tương ứng p=0,196, p=0,508 (bảng 1).. - S ố lượ ng t ế bào b ạ ch c ầu tách đượ c t ừ 10 ml máu ngo ạ i vi ở ngườ i tình nguy ệ n kh ỏ e m ạ nh trung bình là x10 6 tế bào. - Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, với tỷ lệ sống trung bình đạ t 93,6±1,52%. - K ế t qu ả này tương tự như các kế t qu ả trong các nghiên c ứ u khác v ớ i s ố lượ ng t ế bào thu được sau khi tách chiết từ 10 mL máu ngoại vi người khỏe mạnh là 1,16-1,58x10 6 tế bào/ml và tỷ lệ tế bào sống trung bình khoảng 94,5±1,7%. - Kết quả có tỷ lệ B, NK, mono tương đồng và tỷ lệ tế bào T thấp hơn so với nghiên cứu của Hendrika W Số lượng tế bào thu được sau 21 ngày nuôi cấy và hoạt hóa là x 10 8 tế bào và tỷ lệ. - tế bào sống trung bình không có sự khác biệt số lượng tế bào và tỷ lệ tế bào sống với nhóm khỏe mạnh (lần lượt tương ứng p = 0,196, p = 0,508 (bảng 1).. - Trong quần thể tế bào thu được, tế bào NK tiếp theo là tỷ lệ T tế bào NK-T bảng 2, hình 1). - Số lượng tế bào NK tăng sinh trung bình lần, không có sự khác biệt so với nhóm người khỏe mạnh (p = 0,878) (bảng 3).. - Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở người tình nguyện khỏe mạnh trung bình là x 10 6 tế bào.. - Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, với tỷ lệ sống trung bình đạt . - Kết quả này tương tự như các kết quả trong các nghiên cứu khác với số lượng tế bào thu được sau khi tách chiết từ 10 mL máu ngoại vi người khỏe mạnh là 1,16-1,58 x 10 6 tế bào/. - ml và tỷ lệ tế bào sống trung bình khoảng 94,5. - 9 Kết quả trên đã đạt yêu cầu chất lượng tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi người bình thường: Số lượng ≥ 5 x 10 6 tế bào, tỷ lệ sống ≥ 90%, đảm bảo yêu cầu cho giai đoạn nuôi cấy hoạt hóa tiếp theo.. - Quần thể tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi người tình nguyện khỏe mạnh gồm các tế bào miễn dịch nhiều nhất là lympho. - T, tỷ lệ trung bình là tiếp theo lympho B là tế bào NK là 8,28. - Kết quả có tỷ lệ B, NK, mono tương đồng và tỷ lệ tế bào T thấp hơn so với nghiên cứu của Hendrika W Grievink (2016): tỷ lệ tế bào T là 65. - 70%, tế bào B (5. - 9 Ngoài ra, nghiên cứu cho kết quả số lượng tế bào NK sau khi tách từ 10ml máu ngoại vi trung bình là (0,92. - 0,36) x 10 6 tế bào, tương tự với nghiên cứu của Granzin, trung bình 1,5 x 10 6 tế bào NK sau tách từ 20ml máu ngoại vi. - Hiên tại có 2 phương pháp nuôi cấy NK từ tế bào đơn nhân tách từ máu ngoại vi (PBMC) được sử dụng (theo bảng 4) là:. - Bằng các cytokine (riêng rẽ hoặc kết hợp) như IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, không có tế bào trung chuyển (feeder cell): sự tăng sinh tế bào NK không lớn và tế bào T, NK-T có tỷ lệ cao trong quần thể tế bào thu hoạch. - Bằng cách sử dụng tế bào trung chuyển, hay được sử dụng nhất là PBMC được chiếu xạ, EBV-LCL (Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines), K562 được biến đổi gen biểu hiện các phân tử kích thích tế bào NK như phối tử 4-1BBL và IL-15 liên kết màng (K562-mbIL15-41BLL) và các dòng tế bào khối u được chiếu xạ. - Sự tăng sinh tế bào NK dùng cytokine và tế bào trung chuyển mạnh mẽ hơn so với dùng cytokine, không có tế bào trung chuyển. - cấy NK tinh khiết khi thêm EBV-LCL trong 2 tuần dẫn đến số lượng tế bào NK tăng gấp 850 ± 509 lần, trong khi không có EBV-LCL, chỉ với môi trường chứa IL-2, chỉ đạt được sự tăng sinh 14 ± 13 lần. - 7 Bởi vì tế bào T cũng sẽ tăng sinh trong các điều kiện nuôi cấy NK, loại bỏ tế bào CD3. - chọn lọc CD56 + từ PBMC ngay trước khi bắt đầu nuôi cấy đã được sử dụng để thu được quần thể tế bào NK số lượng lớn và tinh khiết cao. - 7,11,13,18 Ví dụ, truyền tế bào NK được cung cấp từ những người hiến tặng có MHC không phù hợp cần hạn chế “ô nhiễm”. - số tế bào T/kg <. - Kết quả nghiên cứu trên nhóm người khỏe mạnh, sau 21 ngày nuôi cấy và hoạt hóa tăng sinh, số lượng tế bào thu được x10 8 tế bào và tỷ lệ tế bào sống trung bình là . - Quần thể tế bào gồm tế bào NK chiếm tỷ lệ chủ yếu là NK-T:. - Giải thích cho kết quả này là phương pháp nuôi cấy NK chúng tôi thực hiện, chỉ dùng cytokine (IL-2, IL-12, IL- 18), không có loại bỏ tế bào CD3. - chọn lọc CD56+ từ PBMC ngay trước khi bắt đầu nuôi cấy tế bào, nên độ tinh khiết của NK chỉ khoảng 62%, tỷ lệ tế bào T và NK-T trong quần thể còn cao. - Tỷ lệ các loại tế bào miễn dịch trong các mẫu thu khá tương đồng với các nghiên cứu cũng chỉ tăng sinh NK bằng cytokine trên thế giới. - việc sử dụng liệu pháp tăng cường tế bào miễn dịch tự thân, tức là tách PBMC từ chính máu ngoại vi của bệnh nhân để nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh rồi truyền trở lại cho bệnh nhân đó, thì quần thể có cả NK-T và T cũng không gây ra GVHD. - Các thử nghiệm lâm sàng về kết hợp giữa truyền tế bào T và NK tự thân đã cho kết quả tích cực được báo cáo ở Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam. - Nghiên cứu cho kết quả sau 21 ngày nuôi cấy PBMC lấy từ 10ml máu ngoại vi người khỏe mạnh, NK tăng sinh trung bình lần, với số lượng tế bào NK tuyệt đối là x 10 8 , cho thấy khả năng tăng sinh tốt của tế bào NK trong môi trường nuôi cấy, đáp ứng số lượng NK để thử nghiệm lâm sàng.. - Với những kết quả thu được trên mẫu người tình nguyện, quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào NK từ máu ngoại vi được áp dụng trên bệnh nhân UTPKTBN.. - Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân UTPKTBN trung bình là x 10 6 , tỷ lệ sống . - Sau 21 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào thu được là x 10 8 , tỷ lệ sống . - Số lượng NK ngày thu là x 10 8 tế bào, số lượng tế bào NK tăng trung bình lần. - Kết quả nuôi cấy tế bào NK giữa 2 nhóm bệnh và nhóm người khỏe mạnh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, tương tự với nghiên cứu của Richard W. - Hiện tại chưa có ngưỡng số lượng tế bào NK cần truyền để đạt được hiệu quả chống khối u 4,7 Theo Richard W., trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 điều tra tính an toàn và hiệu quả của việc truyền tế bào NK tự thân. - tế bào NK/kg vào ngày 0 và liều thứ hai từ 1. - tế bào NK/kg vào ngày 5, thực hiện 78 lần truyền cho 26 bệnh nhân ở các loại ung thư khác nhau, thì 76/78 trường hợp dung nạp tốt (1 trường hợp bị viêm tuyến giáp và 1 trường hợp xuất hiện tình trạng thiếu oxy thoáng qua sau khi truyền tế bào NK/kg vào ngày 5). - 7 Theo Granzin M, họ thu hoạch số lượng NK trung bình là 1,3 ×10 9 tế bào, dùng liều tế bào NK/kg trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn và nhận thấy không có tác dụng phụ, họ tiếp tục tăng liều thử nghiệm là tế bào NK/. - 10 Iliopoulou thực hiện thử nghiệm pha I trên 15 bệnh nhân UTPKTBN, mỗi bệnh nhân từ 2 - 4 lần truyền với liều tế bào NK/kg, cho các kết quả đều an toàn. - Số lượng tế bào NK sau tách từ 30 ml máu ngoại vi ước tính 2x10 6 tế bào NK. - Giai đoạn ban đầu chỉ cần 10 6 tế bào NK là đủ để nuôi cấy hoạt hóa và tế bào cần được để yên, không rung lắc hay di chuyển chai nuôi cấy tế bào trong giai đoạn này, để giữ “sự tương tác” giữa các tế bào NK.. - Giai đoạn tăng sinh, thường sau ngày thứ 7, chuyển từ môi trường hoạt hóa sang môi trường tăng sinh, mật độ nuôi cấy cao hơn và tế bào nên được trộn nhẹ nhàng. - Việc nuôi cấy tế bào NK thường được duy trì từ 14 đến 28 ngày và yêu cầu thêm môi trường để làm mới cytokine, đảm bảo rằng tế bào NK được duy trì ở mức nồng độ tối ưu hóa sự phát triển và khả năng tồn tại của chúng. - 10 Chúng tôi nuôi cấy trong 21 ngày, để đảm bảo số lượng tế bào thu hoạch truyền cho bệnh nhân 50 kg - 70 kg thì ước tính liều truyền sẽ gồm 2,7 x 10 7 tế bào NK/kg, 0,9 x 10 7 tế bào T/kg, 0,55 x 10 7 tế bào NK - T/kg.. - Nghiên cứu đã áp dụng quy trình tách chiết và nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào NK tách từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. - Tế bào thu được sau nuôi cấy đảm bảo đủ số lượng, chất lượng cho thử nghiệm lâm sàng pha I.. - Kết quả của nghiên cứu này thuộc đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma deltaT (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi”