- NUÔI CẤY PHỨC HỢP OCG (OOCYTE - CUMULUS - GRANULOSA) ĐƯỢC THU NHẬN TỪ NANG NOÃN BÒ Ở GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH XOANG SỚM Nguyễn Thị Thanh Giang 1. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm hỗ trợ sự phát triển của noãn bào in vitro bằng cách bổ sung các yếu tố cần thiết trong quá trình nuôi cấy ở môi trường (1) đối chứng (ĐC): TCM-199 + FBS (10. - Các phức hợp noãn bào-cumulus-tế bào hạt (complexes of cumulus-oocyte-granulosa, COCGs) được nuôi cố định bằng agarose 1%. - Kết quả sau 13 ngày nuôi cấy cho thấy, các COCGs đều hình thành cấu trúc “giống xoang nang” ở ngày 3 và 4 của quá trình nuôi trong cả hai môi trường. - Bên cạnh đó, kích thước noãn bào tăng so với trước khi nuôi ở cả môi trường ĐC và TN lần lượt là từ µm đến 107 ± 6,4 µm, và từ µm đến µm (p<0,05). - noãn bào được thụ tinh thành công và phát triển đến giai đoạn phôi 4 tế bào.. - Nuôi cấy phức hợp OCG (Oocyte - Cumulus - Granulosa) được thu nhận từ nang noãn bò ở giai đoạn hình thành xoang sớm.. - Sự phát triển của những nang noãn/noãn bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: các gonadotropin, yếu tố tăng trưởng và các hormone steroid. - Bên cạnh đó, sự tương tác giữa noãn bào với các tế bào lân cận như cumulus hay granulosa là cần thiết cho sự phát triển noãn bào tối ưu. - Nhằm hỗ trợ sự phát triển noãn bào in vitro trong trường hợp các noãn bào này không có khả năng thành thục in vivo, các phức hợp noãn bào-cumulus-granulosa được nuôi cấy trong điều kiện bổ sung các yếu tố cần thiết. - Sodium pyruvate, hypoxanthine và estrogen được khẳng định là có vai trò quan trọng trong sự phát triển của các tế bào nang noãn và sự thành thục của noãn bào (Leese and Barton, 1984. - Harada et al., 1997. - Geshi et al., 2000. - Palter et al., 2001. - Couse et al., 2005. - Hirao et al., 2012;. - Smetanina et al., 2017). - Bên cạnh đó, sodium pyruvate được khẳng định vai trò trong việc thúc đẩy sự thành thục nhân của noãn bào ở bò và sự hiện diện liên tục của các tế bào cumulus trong quá trình thành thục noãn bào rất quan trọng cho sự phát triển tiếp theo của các hợp tử tới giai đoạn blastocyst. - Các nghiên cứu gần đây trên gia súc đã chứng minh tỉ lệ thụ tinh bình thường của các noãn bào nuôi cấy bằng sodium pyruvate cao hơn so với nuôi cấy không bổ sung yếu tố này (Geshi et al., 2000). - Mức tiêu thụ oxy, glucose và pyruvate của các phức hợp noãn bào- cumulus-tế bào hạt (complexes of oocyte-cumulus- granulosa, COCGs) gấp gần hai lần các noãn bào trần (Leese and Barton, 1984. - Hypoxanthine là chất ức chế cAMP- phosphodiesterase trong dịch nang, do đó khi bổ sung hypoxanthine trong môi trường nuôi cấy sẽ giúp duy trì mức độ cAMP trong tế bào soma cũng như trong trứng và duy trì chức năng của chúng, như sự tương tác giữa noãn bào-granulosa.. - Hypoxanthine điều khiển sự tương tác bền vững của noãn bào-granulosa ở bò (Harada et al., 1997).. - Hypoxanthine là một thành phần của hầu hết các môi trường nuôi cấy được sử dụng cho nuôi thành thục noãn bào động vật có vú. - Hypoxanthine được chứng minh có tác động tích cực đến hình thái noãn bào với nồng độ 4 mM, nó giúp duy trì noãn bào ở giai đoạn túi mầm, hỗ trợ sự tồn tại của noãn bào và các tế bào cumulus. - Couse et al., 2005). - bò trong nuôi cấy tăng trưởng phức hợp COCGs phân lập từ các nang có xoang sớm và có được khả năng giảm phân (Hirao et al., 2004. - Hirao et al., 2009).. - Mặc dù các yếu tố trên đều hỗ trợ sự phát triển của noãn bào nhưng chúng chỉ được nghiên cứu hiệu quả tác động đơn lẻ, tối ưu hóa nồng độ tác động.. - Việc tổ hợp các yếu tố này trong quá trình nuôi thành thục noãn bào chưa được chứng minh. - Trên cùng một đối tượng nghiên cứu, việc nuôi cấy các COCGs phân lập từ các nang noãn có xoang sớm (0,5-1,0 mm) được thực hiện khá sớm. - Năm 1997, Harada et al đã nuôi cấy thành công đầu tiên các phức hợp COCGs từ buồng trứng bò. - Cũng trong công bố này, nhóm tác giả khẳng định hypoxanthine giúp duy trì hình thái bình thường và hỗ trợ gia tăng kích thước noãn bào sau nuôi cấy. - Điều này được khẳng định một lần nữa trong nghiên cứu của nhóm tác giả Senbon vào năm 2002 và nồng độ 4 mM được chứng minh là hỗ trợ tốt nhất sự thành thục của noãn bào (Harada et al., 1997. - Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu liên quan đến khảo sát môi trường nuôi cấy dành cho COCGs. - Cụ thể vào năm 2015 và 2016, nhóm nghiên cứu của Makita et al đã công bố hai công trình nghiên cứu khẳng định vai trò hỗ trợ sự tăng trưởng về kích thước và thành thục về chức năng noãn bào bởi estrogen. - Cũng trong hai nghiên cứu này, nhóm tác giả khẳng định môi trường nuôi cấy kết hợp giữa estrogen và androgen cho hiệu quả tác động lên noãn bào tốt hơn khi chỉ sử dụng estrogen (Makita and Miyano, 2015. - Makita et al., 2016).. - Trên các cơ sở đó, thử nghiệm nuôi cấy thành thục noãn bào của bò trong các COCGs, (các phức hợp được thu nhận ở nang noãn có xoang sớm) trong môi trường nuôi có bổ sung estrogen, sodium pyruvate và hypoxanthine được thực hiện.. - Các noãn bào này được rửa lại trong môi trường IVF (TL Fertilization Medium (môi trường thụ tinh) bổ sung albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA) (6 mg/mL), pyruvate stock (10 µL/mL) và heparin (10 µL/mL)) trước khi chuyển sang vi giọt thụ tinh. - 2.2 Thu nhận các phức hợp noãn bào- cumulus-granulosa (COCGs). - Các phức hợp COCGs được phân lập từ những nang noãn này, chỉ những noãn bào có đường kính 90-100 µm mới được nuôi cấy (Hình 1). - Đường kính noãn bào (trừ màng zona) được xác định bằng phần mềm RI (Research Instruments) và hình ảnh được quan sát và ghi nhận dưới kính hiển vi đảo ngược.. - 2.3 Nuôi cấy tăng trưởng các phức hợp noãn bào-cumulus-granulosa (COCGs) in vitro. - Các phức hợp COCGs được nuôi cấy trong đĩa 4 giếng với giá thể gel agarose 1% được chuẩn bị sẵn.. - Môi trường nuôi cấy được bổ sung vào đĩa với thể tích là 500 µL. - Hirao et al., 2004. - Hirao et al., 2009. - Hirao et al., 2012).. - sodium pyruvate (0,1 mg/ml), hypoxanthine (4 mM), estrogen (0,1 µg/ml) (Hirao et al., 2004).. - Môi trường đối chứng (ĐC): TCM199, FBS (10%).. - Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện 38,5 o C, 5% CO 2 . - Ngày đầu tiên của quá trình nuôi cấy là ngày D0 và nuôi cấy tiếp tục cho đến ngày D13. - Sau đó, các noãn bào này sẽ được sử dụng để thực hiện nuôi thành thục (in vitro maturation, IVM) và thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization, IVF).. - Tổng số phức hợp COCGs được nuôi cấy là 124 COCGs, thu nhận từ 20-25 buồng trứng.. - 2.4 Nuôi thành thục noãn bào (IVM) và thụ tinh in vitro (IVF). - Các noãn bào sau quá trình nuôi tăng trưởng in vitro được chuyển vào vi giọt dầu khoáng chứa 100µL môi trường nuôi thành thục noãn bào TCM199 có chứa FBS (10. - Các noãn bào được nuôi cấy trong điều kiện 38,5 o C, 5% CO 2. - Sự thành thục của noãn bào sau nuôi được đánh giá thông qua sự xuất hiện thể cực và khả năng tạo phôi. - Số phức hợp được chia làm 2 nhóm, nhóm đánh giá sự hình thành thể cực sẽ được loại bỏ các cumulus bám xung quanh bằng cách thêm 10 µL dung dịch hyaluronidase (0,3µg/ml) vào mỗi vi giọt nuôi cấy và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ 38,5 o C với 5% CO 2 , bão hòa hơi nước. - Sau thời gian ủ, noãn bào được loại bỏ hết các tế bào cumulus và granulosa bao quanh bằng pipette pasteur, quan sát sự hiện diện của thể cực thứ nhất và đường kính noãn bào (trừ màng zona) được xác định bằng phần mềm RI (Research Instruments).. - 3.1 Phân lập phức hợp COCGs. - Hình 1: Các phức hợp COCGs được phân lập (thang đo 50 µm) 3.2 Sự tăng trưởng noãn bào in vitro. - Đường kính của COCGs ngày càng tăng theo thời gian nuôi cấy.. - cấu trúc giống xoang nang các tế bào granulosa lan rộng, mất cấu trúc giống xoang nang : noãn bào trần. - Sau 13 ngày nuôi cấy, những phức hợp COCGs có cấu trúc giống nang có xoang được tách ra khỏi gel có hình thái noãn bào bình thường tương ứng trong 2 môi trường ĐC và TN là 26 % và 68. - Đường kính noãn bào tăng từ 95 µm đến µm và µm lần lượt ở nghiệm thức ĐC và TN (Bảng 1). - Kết quả phân tích thống kê cho thấy, ở cả hai nghiệm thức, đường kính noãn bào sau nuôi cấy cao hơn đáng kể (p value <0,05) so với trước khi nuôi. - Tỷ lệ noãn bào trần ghi nhận được ở cả hai nghiệm thức ĐC và TN trong suốt quá trình nuôi cấy là 98%. - Đường kính của noãn bào M ± SD (µm) Số lượng. - noãn bào có hình thái bình thường Trước khi. - Hình 3: Đồ thị thể hiện đường kính của noãn bào sau khi nuôi cấy sau 13 ngày a,b,c,d Các giá trị khác nhau mô tả sự khác biệt đáng kể (p<0,05). - Nghiệm thức Số COCGs* Số lượng noãn bào còn granulosa. - Số lượng noãn bào bị bóc trần. - 3.3 Sự thành thục noãn bào in vitro. - Sau khi nuôi tăng trưởng chỉ có những phức hợp noãn bào-cumulus chứa noãn bào có hình thái bình thường mới được nuôi thành thục. - Tổng số 29 phức hợp noãn bào-cumulus thu được từ nghiệm thức TN của nuôi tăng trưởng được chia làm 2 nhóm, lần lượt là nhóm IVM (nuôi thành thục noãn bào in vitro. - Kết quả được thể hiện ở bảng 3 cho thấy: sau 24 giờ nuôi thành thục noãn bào (IVM), tỉ lệ trứng thành thục – xuất hiện thể cực thứ nhất là Hình 4-a). - Bảng 3: Đánh giá sự thành thục của noãn bào ở nghiệm thức TN. - Nuôi thành thục (IVM X. - Hình 4: Noãn bào thành thục. - Theo sinh lý buồng trứng, noãn bào tăng trưởng về kích thước, chuẩn bị nguyên liệu, tiến hành giảm phân nhằm thành thục về chức năng trong suốt quá trình phát triển và sẵn sàng cho quá trình thụ tinh diễn ra sau đó (Harada et al., 1997). - Trong nghiên cứu này chúng tôi có thể khẳng định việc nuôi cấy in vitro các phức hợp COCGs giúp hoàn thiện sự phát triển noãn bào, noãn bào sau quá trình nuôi cấy tăng trưởng có khả năng tiếp tục giảm phân đến giai đoạn metaphase II (ghi nhận bởi sự xuất hiện thể cực thứ I). - Bên cạnh đó, việc bổ sung các yếu tố như sodium pyruvate, hypoxanthine và estrogen vào môi trường nuôi cấy giúp hỗ trợ sự phát triển noãn bào tốt hơn so với môi trường không bổ sung những yếu tố này. - Từ đó có thể khẳng định, sodium pyruvate, hypoxanthine và estrogen góp phần thúc đẩy sự phát triển noãn bào in vitro.. - và estrogen có tỉ lệ tăng trưởng noãn bào là 18,6%.. - Tỉ lệ này cao hơn so với nghiên cứu tương tự, nuôi cấy tăng trưởng noãn bào với yếu tố bổ sung là pypoxanthine của Yamamoto và cộng sự được công bố năm 1999, nhóm tác giả chỉ đạt tỉ lệ tăng trưởng noãn bào là 16,1% (Yamamoto et al., 1999). - Điều này chứng tỏ, sodium pyruvate và estrogen bổ sung vào môi trường nuôi cấy tác động tích cực lên sự tăng trưởng của noãn bào. - (1997) có thể thấy rằng, estrogen được bổ sung trong môi trường nuôi cấy hỗ trợ sự hình thành cấu trúc giống xoang nang tốt hơn.. - Bên cạnh việc đánh giá sự tăng trưởng của noãn bào sau 13 ngày nuôi cấy COCGs in vitro, các noãn bào sau nuôi cấy cũng được đánh giá khả năng thành thục. - Noãn bào được gọi là thành thục khi chúng có khả năng tạo thể cực thứ nhất và tạo phôi khi tiến hành IVF (Senbon and Miyano, 2002. - Huang et al., 2013. - Endo et al., 2014). - 35,7% noãn bào xuất hiện thể cực thứ nhất và 26,7%. - TheoSenbon and Miyano, 2002, tỉ lệ noãn bào thành thục là 23% khi được nuôi tăng trưởng 16 ngày trong môi trường với môi trường tăng trưởng có bổ sung hypoxanthine (Senbon and Miyano, 2002). - Trong một nghiên cứu khác của Endo et al cũng khẳng định, tỉ lệ noãn bào thành thục sau khi nuôi IVM là 22% trong trường hợp nuôi tăng trưởng 16 ngày có bổ sung 17β- estradiol (Endo et al., 2014). - Sự khác biệt trong kết quả đánh giá sự thành thục noãn bào trong nghiên cứu này với các tác giả khác có thể là do thời gian khảo sát khác nhau hoặc cũng có thể là do tác động của việc tổ hợp các yếu tố, haydo số mẫu thu được không đủ lớn để xử lý thống kê. - Ngoài ra, theo nghiên cứu của Huang et al, các noãn bào được nuôi tăng trưởng từ những nang noãn có kích thước 0,5- 1 mm 14 ngày (hoặc hơn) sẽ bị giảm khả năng thành thục (Huang et al., 2013).. - Tuy vậy, nghiên cứu có thể khẳng định rằng, môi trường bổ sung ba yếu tố này hỗ trợ thành thục noãn bào (35,7%) và khả năng tạo phôi IVF (26,7%) tốt hơn so với môi trường không bổ sung (0. - Môi trường nuôi cấy in vitro noãn bào (có đường kính 90-100 µm) trong COCGs có bổ sung các hợp chất hypoxanthine, estrogen, sodium pyruvate đã cải thiện sự tăng trưởng và phát triển của noãn bào.. - Noãn bào sau khi nuôi tăng trưởng 13 ngày sẽ thành thục, xuất hiện thể cực thứ nhất và có khả năng tạo phôi 4 tế bào khi thực hiện IVF.