- NUÔI THÀNH THỤC NOÃN BÒ THU NHẬN TỪ NANG NOÃN. - Matured oocytes received from preantral follicles cultured in vitro. - Nang noãn bò ở giai đoạn hình thành xoang sớm (đường kính 0,5 -1 mm) được thu nhận từ buồng trứng bò cái bị giết mổ và được nuôi cấy tăng trưởng in vitro trong môi trường TCM199 có 10% huyết thanh bào thai bò (FBS, fetal bovine serum).. - Các nang noãn sẽ được nuôi tăng trưởng trong đĩa 4 giếng, có phủ dầu khoáng với 3 nghiệm thức: (1) TCM199, 10% FBS (đối chứng). - Sau 18 ngày nuôi tăng trưởng nang noãn, thu nhận và nuôi thành thục noãn bào trong 24 giờ. - Kết quả cho thấy nuôi cấy nang noãn hình thành xoang sớm (đường kính <1 mm) in vitro có bổ sung các yếu tố tăng trưởng đã cải thiện đáng kể sự tăng trưởng và phát triển của nang noãn. - Tỉ lệ nang noãn đạt đường kính khoảng 3mm trong môi trường có hiện diện FSH, LH, estradiol đạt 53,33%, trong khi đó ở nhóm đối chứng là 16,67%. - Các noãn bào được thu từ những nang noãn này đã xuất hiện thể cực sau 24 giờ nuôi thành thục, tỉ lệ thành thục lên đến 56%. - Nghiên cứu cho thấy, nuôi tăng trưởng nang noãn giai đoạn hình thành xoang sớm cần bổ sung sodium pyruvate, estradiol, FSH và LH.. - Nuôi thành thục noãn bò thu nhận từ nang noãn hình thành xoang giai đoạn sớm trong điều kiện in vitro. - Trong thời gian từ năm Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã thực hiện thành công các nghiên cứu về tạo phôi bò như “Cải tiến trong quy trình tạo phôi bò in vitro làm tăng hiệu suất tạo phôi đến giai đoạn phôi nang” (Ngô Thị Mai Hương và ctv., 2011). - Tuy nhiên, việc nghiên cứu tạo phôi bò in vitro hiện gặp khó khăn về nguồn noãn bào do noãn thu nhận trên buồng trứng bò cái (in vivo) có số lượng ít, số lượng nang noãn nhỏ thường nhiều và nang trội rất ít, thậm chí có những buồng trứng không có nang noãn trội (Ngô Thị Mai Hương và ctv., 2011).. - Mặc dù vậy, buồng trứng bò là “kho” chứa các noãn bào chưa trưởng thành (những noãn bào này nằm trong các nang trứng thứ cấp, tam cấp. - Do đó, trước khi giết mổ, nên thu buồng trứng của chúng để khai thác toàn bộ các nang noãn thứ cấp, tam cấp đem nuôi cấy sẽ có nguồn noãn bào chất lượng cao, tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm (IVF, in vitro fertilization) tạo phôi bò cao sản. - Cho nên, việc nghiên cứu nuôi trưởng thành in vitro các. - noãn bào ở bò thu nhận ở giai đoạn nang noãn thứ cấp, tam cấp. - Xuất phát từ tình hình thực tế, nghiên cứu nuôi thành thục noãn bò thu nhận từ nang noãn hình thành xoang giai đoạn sớm trong điều kiện in vitro được tiến hành.. - 2.2 Xử lý buồng trứng và phân lập nang noãn Mẫu buồng trứng được thu tại lò mổ, bảo quản trong muối đệm phosphate (phosphate-buffered saline, PBS) kháng sinh (penicilin/streptomycin) 2X, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 1-2 giờ sau khi thu nhận. - Các nang trứng sau phân lập được chuyển vào môi trường rửa gồm M199, penicillin 100 mg/mL, streptomycin 100 mg/mL để chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro (Hulshof et al., 1994. - Katska et al., 1998;. - Gutierrez et al., 2000).. - (A): mảnh mô vỏ buồng trứng, (B,C): nang noãn được thu nhận dưới kính hiển vi. - Nang noãn được nhuộm bằng neutral red (30 μg/mL) để đánh giá tỉ lệ sống/chết, nếu nang noãn bắt màu đỏ của thuốc nhuộm chứng tỏ nang noãn sống và ngược lại (Telfer et al., 1998).. - 2.3 Nuôi cấy nang noãn in vitro. - Các nang noãn sau khi chuyển qua môi trường rửa được đưa vào 500μL môi trường có phủ dầu khoáng trong đĩa nuôi 4 giếng tương ứng với các nghiệm thức: (1) TCM199, 10% FBS (đối chứng);. - Katska et al., 1998. - Huang et al., 2013). - Nang noãn được nuôi 18 ngày và thay môi trường nuôi cấy mỗi 3 ngày. - Trong suốt quá trình nuôi nang noãn, đánh giá các chỉ tiêu: sự toàn vẹn của màng nền, hình dạng noãn bào và tế bào granulosa bao quanh nang bằng các hình ảnh ghi nhận qua kính vi thao tác. - 2.4 Nuôi trưởng thành noãn bào in vitro Các nang có kích thước khoảng 3 – 3,9 mm được chọn để thu nhận phức hợp noãn bào cumulus- granulosa và nuôi trưởng thành trong môi trường nuôi trưởng thành noãn bào (IVM, in vitro maturation). - (Younis et al., 1989. - Xiao et al., 2014). - Mật độ noãn bào được nuôi 5-10 phức hợp/vi giọt 100 µL trên đĩa Φ35. - Noãn bào được loại bỏ các tế bào cumulus, granulosa bám xung quanh bằng cách thêm 10 µL dung dịch hyaluronidase (0,3 µg/mL) vào mỗi vi giọt nuôi cấy và ủ trong 20 phút ở nhiệt độ 38,5 o C với 5% CO 2 , bão hòa hơi nước. - Sau thời gian ủ, noãn bào được loại bỏ hết các tế bào granulosa bao quanh bằng pipette pasteur, quan sát sự hiện diện của thể cực thứ. - Sự khác biệt thống kê của đường kính nang noãn được xử lý bằng kiểm định T-test, các số liệu khác xử lý bằng kiểm định χ2 test.. - Chambers et al. - (2010), nghiên cứu đạt tỉ lệ nang noãn sống sau phân lập là 90%. - Với 80,5% nang noãn sống sau phân lập và không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về kết quả này giữa những lần phân lập, do đó quy trình thu nhận nang noãn này được sử dụng để thực hiện các nghiệm thức tiếp theo.. - 3.2 Nuôi cấy nang noãn in vitro. - Nang noãn được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung agarose 1%, sử dụng 3 loại môi trường khác nhau: (1) TCM199, 10% FBS (đối chứng), (2) TCM199, 10% FBS, sodium pyruvate 0,1 mg/mL, (3) TCM199, 10% FBS, sodium pyruvate 0,1 mg/mL, estradiol 1 μg/mL, FSH 0,02 UI/mL và LH. - Tổng số nang noãn sử dụng trong thử nghiệm là 1083 nang, đường kính nang khoảng từ μm. - Sau 18 ngày nuôi cấy, tỉ lệ nang noãn đạt được kích thước khoảng 3 mm ở 3 nghiệm thức lần lượt là và số liệu không trình bày). - Kết quả chi tiết về sự thay đổi đường kính và tỉ lệ nang noãn hình cầu được trình bày trong Bảng 2.. - Bảng 2: Kết quả nuôi cấy nang noãn in vitro. - Môi trường (1) Môi trường (2) Môi trường (3). - Số lượng nang noãn thu nhận . - Đường kính nang noãn X. - nang noãn có dạng hình cầu sau 18 ngày nuôi cấy. - Kích thước nang noãn ở hầu hết các môi trường nuôi đều tăng sau 18 ngày . - Mặc dù không khác biệt khi xử lý thống kê về kích thước nang noãn tại thời điểm ngày 18 giữa các môi trường nuôi với nhau, nhưng nhóm nang được nuôi trong môi trường bổ sung sodium pyruvate, estradiol, FSH và LH (môi trường 3) đạt được đường kính nang lớn nhất, đạt 2965 μm. - Đa số các nang noãn tăng trưởng sau 6 ngày nuôi cấy sẽ sống đến hết quá trình khảo sát.. - Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 18 ngày nuôi, các nang noãn được nuôi trong môi trường bổ sung sodium pyruvate, estradiol, FSH và LH (môi trường 3) có sống lượng nang sống, hình thái bình thường (hình cầu) và tỉ tệ noãn bào thành thục cao nhất.. - Điều này khẳng định vai trò của các yếu tố: sodium pyruvate, estradiol, FSH và LH trong việc phát triển nang noãn in vitro. - đã góp phần khẳng định kết quả trên (Saha et al., 2000). - Một vài nghiên cứu ở bò cho thấy, sự trao đổi chất của noãn bào ở bò khi có sodium pyruvate tăng lên trong suốt quá trình nuôi cấy (Geshi et al., 2000. - Araújo et al., 2014). - Có giả thuyết cho rằng, tế bào cumulus chuyển hóa glucose thành pyruvate hoặc qua chu kỳ trung gian Kreb có thể chuyển đến noãn bào và tăng chất lượng noãn trưởng thành trong thí nghiệm (Geshi et al., 2000). - Theo Jewgenow et al. - Các yếu tố khác như estradiol - được tổng hợp trên tế bào granulosa của các nang noãn đã hình thành xoang, ảnh hưởng đến quá trình phát triển của noãn bào;. - LH bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng làm tăng sức sống của nang, sự hình thành xoang nang (Geshi et al., 2000).. - Theo Sasha et al. - Riêng sự hoạt động của hệ thống cAMP và tăng nồng độ estrogen dẫn đến sự tăng trưởng và phát triển của các noãn bào (Sasha et al., 2000).. - Trong nghiên cứu này, các nang noãn được đồng nuôi cấy nhiều nang trong đĩa nuôi 4 giếng và kết quả cho tỉ lệ nang tăng trưởng còn khá thấp, có 50,33% nang đạt được kích thước khoảng 3 mm (số liệu không trình bày. - Trong nghiên cứu của Katska et al. - (1998), họ chứng minh được việc nuôi cấy riêng lẻ các nang noãn có đường kính >325 μm trong vi giọt, sẽ cho tốc độ tăng trưởng cao hơn so với đồng nuôi cấy nhiều nang noãn. - Điều này cũng giải thích cho việc nuôi cấy đồng thời nhiều nang noãn như trong thí nghiệm của nghiên cứu này sẽ không đạt được kết quả cao. - Bên cạnh đó, nghiên cứu của Gutierrez et al. - (2000) cho thấy IGF-I (yếu tố tăng trưởng giống insulin 1, insulin-like growth factor 1) và EGF (yếu tố tăng trưởng biểu bì, epidermal growth factor) làm tăng tỉ lệ tăng trưởng và hình thành xoang của nang noãn nhưng không tác động lên sự tăng trưởng của noãn bào. - Nghiên cứu của Berisha et al. - (2004), FGF (yếu tố tăng trưởng nguyên bào sơi, fibroblast growth factor) là nhân tố tham gia vào quá trình hình thành nang noãn và đặc biệt là trong quá trình tăng trưởng cuối cùng của các nang ở giai đoạn tiền. - Do đó, việc nuôi cấy nang noãn đơn lẻ và bổ sung các yếu tố tăng trưởng (growth factors) như:. - FGF, IGE, EGF có thể giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng, tỉ lệ nang noãn sống và giữ nguyên cấu trúc đồng thời cải thiện tỉ lệ noãn bào thành thục từ nang sau nuôi cấy. - Từ đó cho thấy, việc bổ sung estradiol, FSH và LH cũng giúp cải thiện đáng kể sự phát triển của nang, tuy nhiên đó vẫn chưa phải là môi trường tối ưu cho sự phát triển của nang noãn.. - 3.3 Nuôi thành thục noãn bào in vitro Noãn bào được thu từ các nang đạt đường kính khoảng 3mm sau 18 ngày nuôi, sau đó được nuôi thành thục trong môi trường IVM trong 24h. - Nhóm noãn bào được thu nhận từ nang noãn nuôi tăng trưởng trong môi trường 3 có tỉ lệ trứng xuất hiện thể cực thứ nhất cao nhất đạt 56,25%, cao hơn so với nhóm 1 và 2 lần lượt là 40% và 50% (Bảng 3). - Các nang này được thu từ 3 môi trường nuôi tăng trưởng khác nhau, nhưng được nuôi thành thục bằng cùng 1 môi trường và tỉ lệ thành thục khác nhau, có thể khẳng định quá trình nuôi tăng trưởng nang đã giúp não bào phát triển toàn diện và môi trường nuôi tăng trưởng đã ảnh hưởng đến tỉ lệ thành thục của noãn bào - xuất hiện thể cực thứ nhất. - Những noãn bào đã xuất hiện thể cực thứ nhất thì có khả năng kết hợp cùng tinh trùng để tạo phôi IVF.. - Bảng 3: Kết quả nuôi trưởng thành noãn bào in vitro IVM. - Môi trường nuôi cấy Môi trường (1) Môi trường (2) Môi trường (3). - Số lượng nang noãn thu nhận để IVM 60 132 192. - Tỉ lệ noãn bào xuất hiện thể cực thứ nhất. - Hình 3: Nuôi thành thục noãn bào in vitro. - cứu nuôi cấy nang noãn kích thước khác nhau của nhóm nghiên cứu Younis et al. - (1989) và Hirao et al. - Theo Younis et al. - phức hợp noãn bào-cumulus-granulosa) từ nang noãn có kích thước lớn hơn 5 mm là 70,4% trong môi trường IVM bổ sung FSH, LH và estradiol.. - Trong khi đó, nhóm nghiên cứu Hirao et al. - (2014) đạt kết quả IVM là 52,1% đối với các noãn bào thu nhận từ những nang noãn có kích thước 0,5-0,8 mm. - sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường bổ sung FSH, LH, EGF (yếu tố tăng trưởng ngoại bì, epidermal growth factor) (Hirao et al., 2014). - Có thể đưa ra khuyến cáo noãn bào tăng trưởng in vivo càng lâu thì khả năng trưởng thành in vitro càng cao và việc bổ sung estradiol hay EGF có hỗ trợ thêm sự trưởng thành noãn bào in vitro.. - Phương pháp để thu nhận nang noãn từ mô vỏ buồng trứng bò trong thời gian nhanh và tỉ lệ nang sống sau phân lập cao, đó là nang trứng cần được phân tách cơ học kết hợp enzyme. - Quá trình nuôi cấy nang noãn đã hình thành xoang sớm (đường kính <1 mm) in vitro rất cần thiết có sự bổ sung kết hợp với nhau giữa các yếu tố như: FSH, LH, estradiolvà sodium pyruvate. - Một số cải tiến trong quy trình tạo phôi bò in vitro làm tăng hiệu suất tạo phôi đến giai đoạn phôi nang. - In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. - Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. - In vitro growth and maturation of vitrified-warmed bovine oocytes collected from early antral follicles. - The isolation and in vitro culture of bovine preantral and early antral follicles of different size classes.. - In vitro culture of bovine preantral follicles.. - R., et al., 2014