- PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH GUMBORO TRÊN ĐÀN GÀ VỚI CHỦNG VIRUS VACCINE QUA VÙNG SIÊU BIẾN ĐỔI GEN VP2 Ở TRÀ VINH Trần Ngọc Bích 1 , Nguyễn Văn Lộc 2 , Ngô Phú Cường 3 và Nguyễn Phúc Khanh 1. - 2 Chi Cục quản lý chất lượng Nông Lâm Thủy sản Trà Vinh. - Gumboro, Fabricius, Gà, Vaccine, gen VP2, tỉnh Trà Vinh. - Phân tích di truyền cho thấy tất cả các mẫu đều dương tính với vius gây bệnh Gumboro (infectious bursal disease virus). - Vật liệu di truyền của virus được sử dụng để xác định trình tự chuỗi nucleotide của vùng siêu biến đổi gen VP2, sau đó những trình tự này được so sánh với trình tự của 04 mẫu virus vaccine đang sử dụng tại Trà Vinh.. - Kết quả cho thấy sự khác biệt về di truyền của chủng virus đang lưu hành với một số chủng virus vaccine như sau: dựa vào trình tự gen và phân tích phả hệ di truyền cho thấy các mẫu phân lập thuộc phân nhóm có độc lực cao và có quan hệ gần với các chủng virus cường độc khác của Việt Nam (G202, GPT, GT1ST, GTG25) và Trung Quốc (QX110609, WM12061, Xin1). - Mức độ tương đồng về amino acid của chủng virus đang lưu hành với mẫu virus vaccine Gumboro Navetco – Việt Nam là 90,4%, với vaccine BUR-706 của MERIAL – PHÁP là 91,8%, và với vaccine IBD BLEN của MERIAL – Mỹ là 95,2%, đặc biệt tương đồng cao với mẫu virus vaccine Medivac Gumboro A của Medion – Indonesia (97,9. - Kết quả này chứng tỏ vaccine Medivac Gumboro A của Medion – Indonesia có khả năng bảo hộ cao hơn 3 loại vaccine còn lại.. - Phân biệt chủng virus gây bệnh gumboro trên đàn gà với chủng virus vaccine qua vùng siêu biến đổi gen VP2 ở Trà Vinh. - Virus gây bệnh Gumboro (IBDV) thuộc chi Avibirnavirus, họ Birnaviridae(Murphy et al., 1999). - Các chủng virus được chia thành 2 type huyết thanh (McFerran et al., 1980). - Serotype 1 bao gồm 6 subtypes có phạm vi rộng về độc lực từ gây bệnh cho đến rất độc cho gà (Jackwood and Saif, 1987). - Những virus thuộc serotype 2 thì không gây bệnh (Cummings et al., 1986).. - Tùy thuộc vào mức độ độc lực mà người ta chia các virus thuộc serotype 1 ra thành 4 nhóm chính:. - nhóm cường độc, nhóm cổ điển, nhóm biến đổi và nhóm nhược độc (Wu et al., 2007).. - Hiện nay, mặc dù có nhiều loại vaccine phòng bệnh nhưng bệnh vẫn thường xuyên xảy ra. - Do đó, mục tiêu được đặt ra của nghiên cứu này là xác định chủng virus gây bệnh ở tỉnh Trà Vinh và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu. - Đàn gà nuôi thả vườn nghi mắc bệnh Gumboro tại tỉnh Trà Vinh. - Máy giải trình tự ABI PRISM® 3730XL Analyzer, Máy PCR Agilent SureCycler 8800, Bộ điện di nằm ngang Minis 150VS và bộ nguồn.. - Các hóa chất, bộ kit dùng trong phản ứng RT- PCR.. - Các loại vaccine dùng trong nghiên cứu:. - Vaccine 1: Gumboro Navetco – Việt Nam. - Phương pháp nghiên cứu. - So sánh chủng virus gây bệnh ngoài thực địa với chủng vaccine thông qua lấy mẫu bệnh phẩm để tiếp tục xét nghiệm trong phòng thí nghiệm bằng phản ứng RT-PCR.. - Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR là GF-GR:. - Sử dụng chương trình Blast để truy cập và xác định bằng cách so sánh với trình tự chuỗi DNA của các chủng IBDV đã được công bố trong ngân hàng gen. - Trình tự chuỗi amino acid được chuyển đổi bằng phần mềm DNAClub và chương trình SeqVerter (http://www.genestudio.com).Trình tự nucleotid và amino acid suy diễn được phân tích so sánh bằng phần mềm BioEdit 7.1.9.0 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Kết quả xét nghiệm mầm bệnh trong phòng thí nghiệm. - Để khẳng định một cách chắc chắn rằng những đàn gà khảo sát đã mắc bệnh Gumboro, chúng tôi tiến hành xác định sự có mặt của một đoạn gen của hệ gen IBDV trong mẫu túi Fabricius được thu thập từ các đàn gà nghi mắc bệnh Gumboro, đó chính là đoạn gen ở vùng siêu biến đổi của gen VP2 bằng phản ứng RT-PCR, sử dụng cặp mồi GF-GR, đây là cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán phân tử bệnh Gumboro, cho sản phẩm RT-PCR có độ dài khoảng 0.47 kb (Hình 1).. - Kết quả phân tích cho thấy đoạn gen trên đã được phát hiện trong tất cả các mẫu bệnh phẩm thu thập tại các ổ dịch trong tỉnh (Bảng 1). - Do đó, có thể kết luận rằng 100% các mẫu thí nghiệm dương tính với virus bệnh Gumboro và kết quả này phù hợp với chẩn đoán lâm sàng thông qua những triệu chứng bệnh-tích đặc trưng của bệnh Gumboro trên đàn gà mắc bệnh.. - Từ kết quả ở Bảng 1 và Hình 1 có thể kết luận biểu hiện triệu chứng và bệnh tích của những đàn gà bệnh Gumboro ở Trà Vinh là khá rõ nét, vì vậy tất cả các mẫu xét nghiệm đều cho kết quả dương tính với phản ứng RT-PCR. - Điều này có thể khẳng định bệnh Gumboro đang xảy ra ở nhiều địa bàn trong tỉnh và có thể ở Trà Vinh đang lưu hành một dòng virus IBDV có độc lực cao.. - Bảng 1: Kết quả xác định virus Gumboro từ 20 mẫu bệnh phẩm của 16 đàn gà bệnh Địa điểm Số mẫu xét. - Tỉ lệ. - Trà Vinh 03 03 100. - 3.2 Kết quả so sánh virus chủng thực địa với chủng virus vaccine. - 3.2.1 Kết quả thực hiện RT-PCR. - Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR của 20 mẫu bệnh và 4 mẫu vaccine được trình bày trong Hình 1.. - bệnh phẫm và 4 loại vaccine dùng trong nghiên cứu đều có chứa đoạn gen ở vùng siêu biến đổi của gen VP2 của virus gây bệnh Gumboro với kích thước 474bp. - Hình 1 cho thấy đoạn gen mục tiêu có kích thước 474bp thu được sau phản ứng RT- PCR là các băng gọn, rõ ràng, không bị đứt gãy, tập trung thành một phân đoạn đủ độ sạch để tiến hành giải trình tự.. - Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân đoạn gen VP2 kích thước 474bp. - 3.2.2 Kết quả giải trình tự, phân tích so sánh Aa và Nucleotide của các mẫu nghiên cứu. - Sản phẩm của phản ứng RT-PCR (Hình 1) được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3730XL Analyzer (Hình 2).. - Hình 2 cho thấy mẫu đã được giải trình tự rõ ràng, mỗi đỉnh màu của giản đồ (chromatogram) đều xác định một loại nucleotide, chứng tỏ chuỗi nucleotide ở vùng siêu biến đổi của gen kháng. - nguyên VP2 thu nhận sau quá trình giải trình tự có chất lượng tốt.. - Trình tự đoạn gen 441 nucleotide (từ vị trí ở vùng siêu biến đổi của gen VP2 thu thập từ 20 mẫu IBDV tại thực địa được phân tích và so sánh với 04 loại virus vaccine phòng bệnh Gumboro đang sử dụng phổ biến tại địa phương bằng chương trình DNAClub và SeqVerter. - sau đó phân tích so sánh bằng chương trình BioEdit 7.1.9.0. - Kết quả phân tích được trình bày qua Bảng 2.. - Hình 2: Giản đồ (chromatogram) một phần trình tự vùng siêu biến đổi gen kháng nguyên VP2 Ghi chú: Các nucleotide đánh dấu huỳnh quang ở ddNTPs khi đọc bằng tia laser cho hiển thị qua vi tính thì Adenine có màu xanh lá cây, Thymine có màu đỏ, Guanine có màu đen và Cytosine có màu xanh nước biển. - Bảng 2: Sai khác về Aa tại các vị trí quan trọng có vai trò quyết định tính kháng nguyên và độc lực của IBDV tại đoạn gen VP2. - Phân nhóm Các vị trí amino acid biến đổi quan trọng. - Độc lực yếu P V H V N T L N R. - Độc lực vừa P/T V Q V D/N A L N R. - Độc lực cao A I Q I I A I S A. - Kết quả so sánh độc lực của 20 chủng virus thực địa và 4 chủng virus vaccine phòng bệnh IBDV được trình bày ở Bảng 2. - Qua Bảng 2 cho thấy hai mẫu virus vaccine 1 và 2 chỉ sai khác duy nhất 1 amino acid ở vị trí 329 khi đối chiếu với. - vaccine này chứa chủng virus có độc lực thấp. - ở motif của virus có độc lực trung bình bắt đầu có sự biến đổi Aa ở vị trí 253 từ Histidine (H) thành Glutamine (Q), sự thay đổi này tác dụng làm tăng độc lực của virus (Jackwood et al., 2008) và khi so. - trong khi đó mẫu vaccine 3 và các mẫu virus thu thập được từ thực địa chỉ sai khác duy nhất 1 Aa ở vị trí 279 khi đối chiếu với motif có độc lực cao chứng tỏ đây là các chủng virus cường độc. - Mặt khác, khi đối chiếu giữa mẫu virus vaccine 3 và các mẫu thực địa thì cũng chỉ sai khác ở vị trí Aa này qua đó cho thấy mẫu virus vaccine 3 tương đồng cao với mẫu thực địa về tính kháng nguyên-miễn dịch. - 3.2.3 Phân tích tương đồng về nucleotide và amino acid. - Tương đồng về nucleotide và Aa của các mẫu virus thực địa và mẫu vaccine. - Đoạn gen 441 nucleotide mã hóa cho 147 Aa vùng siêu biến đổi ở gen VP2 của các mẫu virus thu thập được từ thực địa và 04 mẫu virus vaccine được đưa vào chương trình Bioedit để phân tích mức độ tương đồng về nucleotide và Aa giữa các nhóm độc lực với nhau (Bảng 3).. - Kết quả phân tích Bảng 3 cho thấy giữa hai mẫu vaccine thuộc nhóm độc lực yếu (vaccine1 và vaccine 2) với nhau có tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid khá cao lần lượt là 98%. - Trái lại khi đối chiếu với các mẫu virus thực địa thì hai mẫu vaccine này có mức độ tương đồng thấp (tương đồng về nucleotide từ 91% đến 93%, tương đồng về Aa từ 90% đến 92. - Khi so sánh mẫu virus vaccine 4 và các mẫu virus thực địa. - thì có mức độ tương đồng khá hơn 2 mẫu vaccine 1 và 2, cụ thể tương đồng về nucleotide từ 92% đến 94%, về amino acid là 95%. - Trong các mẫu virus vaccine, thì vaccine 3 có mức độ tương đồng cao nhất với các mẫu virus thực địa: 96% đến 98% về nucleotide và 98% về amino acid.. - Giữa các mẫu virus thuộc nhóm độc lực cao với nhau tỉ lệ tương đồng là khá cao. - Trong các mẫu virus thực địa với nhau mức độ tương đồng nucleotide và amino acid là rất cao: từ 98%-100%. - về nucleotide và đồng nhất hoàn toàn về amino acid. - Điều này một lần nữa khẳng định các mẫu virus thu thập được thuộc cùng một nhóm kháng nguyên có độc lực cao (cùng serotype).. - Từ kết quả so sánh trên có thể đi đến nhận xét rằng: tính hiệu quả của vaccine phòng bệnh Gumboro trên đàn gà ở Trà Vinh sắp xếp theo thứ tự giảm dần từ vaccine 3 đến vaccine 4 đến vaccine 2 và cuối cùng là vaccine 1.. - Vaccine 3 là loại vaccine hiệu quả nhất trong 4 loại vaccine phòng bệnh nhưng trong quá trình sử dụng cần phải thận trọng và tuyệt đối tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất vì đây là loại vaccine chứa chủng virus có độc lực cao.. - Vaccine 1 là loại vaccine kém hiệu quả nhất, thực tế khảo sát cho thấy nhiều đàn gà được phòng bệnh bằng vaccine 1 nhưng bệnh vẫn xảy ra.. - Nhưng đây là loại vaccine rất an toàn khi sử dụng.. - Tương đồng về nucleotide và Aa của các mẫu virus trong nghiên cứu với một số chủng virus IBDV khác của Việt Nam và thế giới. - Theo nghiên cứu của Lê Thị Kim Xuyến (2010) đã xác định đặc tính độc lực và nguồn gốc của một số chủng virus ở Việt Nam như Bảng 4.. - Bảng 4: Phân nhóm độc lực virus tại Việt Nam Phân nhóm Chủng virus Nguồn gốc Độc lực. - D78 Độc lực vừa. - Độc lực cao. - HK46 Hong Kong - TQ Kết quả phân tích tương đồng về chuỗi nucleotide và amino acid ở đoạn gen trên của các mẫu virus trong nghiên cứu với một số chủng khác của Việt Nam và thế giới (Bảng 5) cho thấy: các mẫu virus thu thập được từ thực địa có mức độ tương đồng về nucleotide khá cao từ 95,4% đến 97,9% với một số chủng khác của Việt Nam và châu Á (GTG25, GZ-96, Xin1, SDH1, G202, GPT, GT1ST, QX110609, WM12061) từ đó dẫn đến mức độ tương đồng amino acid cao với các chủng này, cụ thể: tương đồng 99,3% với các chủng GTG25 (Tiền Giang), GZ-96 (Singapore), Xin1. - đặc biệt đồng nhất hoàn toàn với các chủng G202, GPT (Hà Nội), GT1ST (Sóc Trăng) và QX110609, WM12061 (Trung Quốc) mà đây là những chủng virus có độc lực cao. - Điều này một lần nữa khẳng định chủng virus đang lưu hành ở Trà Vinh là loại có độc lực cao và có thể có quan hệ nguồn gốc với các tỉnh lân cận (Sóc Trăng, Tiền Giang) và Trung Quốc.. - Một mức độ tương đồng cao về nucleotide và amino acid khi đối chiếu mẫu virus vaccine 4 với chủng GSG16 và BDG23 với tỉ lệ lần lượt là 98,6% và 99,7% về nucleotide. - Những chủng virus này được ghi nhận là có độc lực trung bình do đó có thể thấy được mẫu virus vaccine 4 là loại có độc lực trung bình.. - Trong 04 mẫu vaccine thì mẫu virus vaccine 3 có mức độ tương đồng về Aa với những chủng virus có độc lực cao ở Việt Nam và châu Á nhất:. - tương đồng 97,9% với các chủng G202, GPT, GT1ST, QX110609, WM12061 và các mẫu virus thực địa tương đồng 98,6% với các chủng GZ 96, Xin1 và SDH1. - Kết quả này chứng tỏ đây là vaccine chứa chủng virus có độc lực cao và có thể đây là loại vaccine khá hiệu quả với những nơi bệnh Gumboro xảy ra thường xuyên và lưu hành dòng virus có độc lực cao, như tại Trà Vinh.. - Mẫu virus vaccine 1 và 2 tương đồng Aa khá cao với các chủng virus nhược độc khác trên thế giới (châu Âu, châu Mỹ) như BursaG, GA-1, D78 với tỉ lệ từ 96,5. - đồng thời có tương đồng thấp hơn với các chủng cường độc (Việt Nam, Trung Quốc) như G202, GTG25, GT1ST, QX110609, WM12061 với tỉ lệ từ 90,4. - Các mẫu virus thu thập được ở Trà Vinh thuộc cùng một nhóm và đây là nhóm virus cường độc.. - Đồng nhất hoàn toàn với các chủng độc lực cao ở Việt Nam (G202, GPT, GT1ST) và Trung Quốc (QX110609, WM12061) qua phân tích thành phần amino acid của vùng siêu biến đổi VP2 của virus gây bệnh Gumboro.. - Trong 4 mẫu vaccine thì vaccine 3 có mức độ tương đồng cao nhất về nucleotide và amino acid với các mẫu thực địa, kế đến là mẫu vaccine 4, rồi đến vaccine 2 và cuối cùng là vaccine 1.. - Studies on naturally occurring infectious bursal disease viruses suggest that a single amino acid substitution at position 253 in VP2 increase pathogenicity. - Đặc tính phân tử của các chủng virus Gumboro cường độc Việt Nam qua khảo sát chuỗi gen kháng nguyên VP2.. - Giải mã phân đoạn A hệ gen các chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới