- PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT. - Hai mươi lăm mẫu nước thải đã được thu thập từ nước thải tại làng nghề sản xuất bột gạo tại thị xả Sa đéc, tỉnh Đồng Tháp để tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột. - Hai mươi ba dòng vi khuẩn phân lập được có hình dạng tế bào rất biến động từ hình que ngắn, que dài đến hình chuỗi. - Hầu hết các dòng vi khuẩn có khả năng di động. - Trong số 23 dòng vi khuẩn phân lập được có 13 dòng vi khuẩn thuộc gram âm và 10 dòng vi khuẩn thuộc gram dương. - Các dòng vi khuẩn phân lập được có họat tính enzyme amylase từ 72,44U/ml đến 910,89U/ml sau 72 giờ nuôi cấy. - Hai dòng 9 35 và VD2 có khả năng xử lý đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ.. - Từ khóa: phân hủy tinh bột, nước thải tinh bột, amylase, phân lập.. - Tổng lượng nước thải của làng nghề này thải ra môi trường hàng ngày khoảng 4.000m3 và 1,6 tấn rác thải sinh hoạt (Trung Tâm Kỹ Thuật Môi Trường TP. - Thành phần chủ yếu của loại nước thải này chứa các tạp chất hữu cơ ở dạng hòa tan hoặc lơ lửng, trong đó chủ yếu là các hợp chất carbohydrat như tinh bột, đường, các loại acid hữu cơ (acid lactic). - Ngày nay bên cạnh công nghệ xử lý nước thải bằng phương pháp lý, hóa, sinh học thì việc ứng dụng những dòng vi khuẩn có khả năng chuyên biệt để hoàn thiện công nghệ xử lý chất thải đang chiếm một vai trò vô cùng quan trọng. - Nhóm vi sinh vật phân hủy tinh bột sống trong đất, nước có khả năng tiết ra môi trường hệ enzyme amylase nhằm thủy phân tinh bột thành các hợp chất đơn giản. - trường tự nhiên có nhiều dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột như Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Pseudomonas. - Vì vậy việc nghiên cứu, phân lập các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme amylase và ứng dụng các vi sinh vật này vào xử lý nước thải tinh bột là một việc làm rất thiết thực, mang tính ứng dụng cao.. - Từ nhu cầu thực tiễn như trên đề tài: Phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ao nước thải tại làng nghề sản xuất bột gạo Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp được thực hiện với mục tiêu phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tốt có trong nước thải góp phần bảo vệ nguồn nước cho cộng đồng trong khu vực.. - Hai mươi lăm mẫu nước thải và bùn của ao chứa nước thải tại làng nghề sản xuất bột xã Tân Phú Đông – TX Sa Đéc – Tỉnh Đồng Tháp được thu thập. - Chọn 5 hộ gia đình, mỗi hộ lấy 5 mẫu nước thải và 5 mẫu đất tại các vị trí khác nhau. - Dùng các chai nhựa sạch thu nước thải từ độ sâu 50cm đến lớp nước mặt sao cho đầy chai 500ml. - Mẫu nước và mẫu bùn trữ trong các thùng mốp có nước đá để mang về phòng thí nghiệm phân lập vi khuẩn.. - Môi trường phân lập vi khuẩn gồm (g/L):Bacteriological peptone, 6. - 2.2.1 Phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột. - Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc đang phân hủy tinh bột (những khuẩn lạc có xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc) tiến hành tách ròng bằng phương pháp ria cấy. - Tiến hành làm tiêu bản quan sát để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã phân lập.. - 2.2.2 Khảo sát một số đặc tính hình thái của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn. - Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc như: hình dạng, màu sắc, kích thước, độ nổi và dạng bìa của khuẩn lạc, khả năng chuyển động của vi khuẩn, đo kích thước tế bào vi khuẩn, nhuộm Gram.. - 2.2.3 Khảo sát khả năng phân huỷ tinh bột của các dòng vi khuẩn phân lập được Cấy dòng vi khuẩn cần khảo sát lên môi trường đặc Nutrient agar có chứa tinh bột (1%w/v). - Sau 3 ngày ủ ở 30 o C, các khuẩn lạc vi khuẩn được hình thành, enzyme. - amylase được tổng hợp và thủy phân tinh bột và tạo thành một vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc. - Rót dung dịch Gram’s Iodine lên mặt thạch, tráng đều và quan sát để kiểm tra sự thủy phân tinh bột. - Dựa vào tỉ lệ giữa đường kính của vòng thủy phân với đường kính của khuẩn lạc ta đánh giá khả năng tổng hợp enzyme amylase của dòng vi khuẩn được khảo sát.. - 2.2.4 Khả năng tổng hợp enzyme amylase của vi khuẩn. - Môi trường xác định khả năng sinh amylase của vi khuẩn gồm (g/L):. - Dùng pipet vô trùng lấy 5 - 6 ml nước vô trùng cho vào ống giống, dùng que cấy đánh nhẹ cho khuẩn lạc của vi khuẩn trong ống giống tan vào nước. - Chuyển dung dịch vi khuẩn vào trong những ống ly tâm và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 20 phút. - 2.2.6 Khảo sát hoạt tính của enzyme. - Amylase thủy phân tinh bột cho ra đường khử. - Một đơn vị hoạt tính enzyme amylase là lượng enzyme cần thiết thủy phân cơ chất tinh bột cho ra 1µM đường khử trong một đơn vị thời gian là 1 phút ở pH 6.0 và nhiệt độ 40 o C.. - 2.2.7 Khảo sát khả năng phân hủy tinh bột trong nước thải. - Để xác định khả năng phân hủy tinh bột có trong nước thải, tăng sinh hai dòng vi khuẩn phân lập được từ thí nghiệm trước trong môi trường dinh dưỡng trong 3 ngày để đạt mật độ 10 9 CFU/ml. - Thí nghiệm một nhân tố bao gồm 5 nghiệm thức với thể tích nước thải là 200 ml (với 3 lần lặp lại).. - Nghiệm thức 2: chủng 1% vi khuẩn (v/v. - Nghiệm thức 3: chủng 2% vi khuẩn - Nghiệm thức 4: chủng 3% vi khuẩn. - Nghiệm thức 5: chủng 4% vi khuẩn. - Sau 24g lấy mẫu để đánh giá hiệu quả phân hủy tinh bột trong nước thải của dòng vi khuẩn thông qua các chỉ tiêu: pH, hàm lượng glucose sinh ra.. - 3.1 Kết quả phân lập và một số đặc tính hình thái của các vi khuẩn. - Từ mẫu nước thải và mẫu bùn đáy được lấy tại làng nghề sản xuất bột gạo xã Tân Phú Đông, TX Sa Đéc, 23 dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột đã được. - phân lập. - Trong 23 dòng vi khuẩn có 8 dòng được phân lập ở điều kiện yếm khí (Y) (chiếm 34,78. - và 15 dòng được phân lập ở điều kiện hiếu khí (HK) (chiếm 65,22. - Các dòng vi khuẩn này có khuẩn lạc to, đường kính trung bình từ 0,5mm đến 1,5mm. - Thời gian phát triển nhanh trong môi trường tinh bột tan (sau 20 giờ) ở nhiệt độ phòng (30 o C), và hầu hết đều gây mùi chua trên môi trường chứa 1%. - tinh bột.. - Trong đó các dòng vi sinh vật có màu trắng và trắng sữa là 19 dòng (chiếm 82,61. - Tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập có dạng que ngắn, que ngắn cặp và que ngắn 16 dòng(chiếm 69,57. - còn lại là 2 dòng vi khuẩn có hình cầu kết chuỗi (chiếm 8,69. - Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng chuyển động trong môi trường lỏng. - Kết quả nhuộm Gram cho thấy trong 23 dòng vi khuẩn phân lập được có 13 dòng thuộc nhóm Gram âm (chiếm 56,52%) và 10 dòng thuộc nhóm Gram dương (chiếm 43,48%).. - 3.2 Kết quả định tính hoạt tính Amylase. - Phần môi trường chứa tinh bột chưa bị thủy phân bởi enzyme amylase sẽ cho màu tím xanh với dung dịch Iod, riêng vùng sáng là do tinh bột đã bị thủy phân do đó không cho phản ứng màu với Iod. - Tuy nhiên, đường kính vòng halo giữa các dòng vi khuẩn khác nhau tùy thuộc vào loài vi khuẩn và khả năng thủy phân tinh bột. - Theo các tác giả này thì các khuẩn lạc có khả năng phân hủy tinh bột (Amy. - Sự hiện diện của vòng halo thủy phân tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể sử dụng để đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn.. - Hình 1: Môi trường được nhuộm với Iod để thấy tinh bột bị thủy phân (vùng sáng). - Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn phân lập được có thể đánh giá sơ bộ dựa trên hiệu số giữa đường kính của vòng sáng xung quanh khuẩn lạc và đường kính của khuẩn lạc, hiệu số càng lớn thì khả năng phân hủy tinh bột càng cao. - Các dòng Y, VD2 có khả năng phân hủy tinh bột tốt (Hình 2).. - 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính amylase. - Các dòng này được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng chứa peptone như nguồn nitơ và tinh bột như là nguồn carbon với pH = 7,0. - Mười bảy dòng vi khuẩn được khảo sát đều có hoạt tính của enzyme amylase từ U/ml đến U/ml. - Trong đó cao nhất gồm các dòng và VD2 có hoạt tính amylase là U/ml U/ml U/ml và U/ml. - Dòng 9 35 và VD2 là hai dòng vi khuẩn có đường kính trung bình của vòng halo lớn và tăng sinh khối nhanh. - Khi chọn một số dòng vi khuẩn để kiểm tra hoạt tính chúng tôi nhận thấy các dòng vi khuẩn có khả năng sinh lượng đường khử glucose cao thì hoạt tính enzyme amylase cao (Hình 4). - Hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn được kiểm định qua phép thử Ducan, kết quả như sau: dòng 19, dòng 14, dòng 10, dòng 9 36 , dòng 16 và dòng 9 35 cho hoạt tính enzyme amylase có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. - Riêng hai dòng VD2 và 9 2 cho hoạt tính enzyme amylase khác biệt không ý nghĩa thống kê ở độ ý nghĩa 5%.. - Hình 4: Hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn. - Nồng độ glucose sinh ra do vi sinh vật thủy phân tinh bột cũng tương quan với thời gian nuôi cấy (Smitt et al., 1996). - Thí nghiệm khảo sát hàm lượng glucose qua các thời gian nuôi là 24g, 48g, 72g và 96g trong môi trường dinh dưỡng lỏng với các dòng và VD2.. - Theo Sasmita Mishra và Niranjan Behera (2008), khi tăng thời gian nuôi các dòng vi khuẩn Bacillus trong môi trường có nguồn carbon là tinh bột thì hoạt tính enzyme amylase tăng và hoạt tính enzyme amylase đạt cực đại sau 72g.. - Sự tổng hợp enzyme thủy phân carbohydrate như tinh bột ở hầu hết các loài thuộc giống Bacillus đều bị ức chế do sự chuyển hóa nhanh glucose (Lin et al., 1998).. - 3.4 Kết quả thí nghiệm xử lý nước thải. - Chọn hai dòng vi khuẩn là 9 35 và VD2 để nhân mật số đến 10 9 CFU/ml và tiến hành bố trí thí nghiệm khảo sát hàm lượng tinh bột và pH theo thời gian xử lý (Bảng 1).. - Bảng 1: Đặc điểm của 2 dòng vi khuẩn được chọn trong thí nghiệm xử lý nước thải. - Khuẩn lạc. - Khả năng chịu nhiệt ( 100 0 C, 3h. - Hoạt tính amylase sau 72h (U/ml . - Nguồn phân lập Mẫu bùn đáy Mẫu bùn đáy. - Dòng 9 35 sau 24g xử lý thì các nghiệm thức 2%, 3% và 4% đạt hiệu quả xử lý trên 90% so với nghiệm thức đối chứng. - Riêng nghiệm thức 1% chỉ đạt hiệu quả xử lý là 73,78 % so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ ý nghĩa 5%. - Bảng 2: Kết quả xử lý nước thải của dòng vi khuẩn 9 35 sau 24g. - Nghiệm thức Lượng tinh bột (g/l) pH Khả năng xử lý. - CV tinh bột 24h. - Dòng VD2, các nghiệm thức 2%, 3% và 4% đạt hiệu quả xử lý trên 95% so với nghiệm thức đối chứng sau 24g. - Riêng nghiệm thức 1% đạt hiệu quả xử lý là 85,28% so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ ý nghĩa 5%. - So với dòng 9 35 , dòng VD2 đạt hiệu quả xử lý tinh bột sau 24g cao hơn do dòng vi khuẩn này có hoạt tính enzyme amylase sau 24g cao hơn.. - Bảng 3: Kết quả xử lý nước thải của dòng vi khuẩn VD2 sau 24g. - Hai mươi ba dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột đã được phân lập từ các ao nước thải làng nghề sản xuất tinh bột. - Các dòng vi khuẩn này có hoạt tính enzyme amylase khá cao từ 72,44U/ml đến 910,89 U/ml. - Các dòng 9 35 và VD2 và dòng 9 35 có khả năng xử lý nước thải đến trên 97% sau 24g.. - Cần bố trí thí nghiệm để đánh giá khả năng xử lý nước thải từ cơ sở sản xuất tinh. - bột ở điều kiện thực tiễn trước khi sản xuất chế phẩm sinh học để xử lý môi trường.. - Trung Tâm Kỹ Thuật Môi Trường TP