- PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP IAA VÀ CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN CÂY CHUỐI. - Achromobacter sp., cố định đạm indole acetic acid, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn nội sinh. - Sử dụng phân bón vi sinh để thay thế cho phân bón hóa học là vấn đề đang được quan tâm và chú ý vì phân bón vi sinh không những giúp nâng cao năng suất cây trồng mà còn thân thiện với môi trường. - Trong nghiên cứu này, 43 dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ chuối trồng tại một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Trà Vinh và Hậu Giang. - Trong số các dòng này có 25 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb và 18 dòng được phân lập từ môi trường Baz. - Các dòng vi khuẩn có đặc điểm: Khuẩn lạc có dạng tròn, độ nổi mô, bìa nguyên, chủ yếu có màu trắng sữa hoặc trắng trong trên môi trường NFb và màu trắng hoặc vàng trên môi trường Baz, tế bào có chiều dài dao động trong khoảng 0,5-2,5 µm và chiều rộng dao động trong khoảng 0,5-2 µm, đa số hình que, chuyển động, Gram âm.. - Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng tổng hợp chất kích thích tăng trưởng indole acetic acid (IAA) và cố định đạm. - Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+, các dòng N5 và N12 cho kết quả cao nhất với nồng độ NH4+. - Trong khi đó các dòng vi khuẩn trên môi trường NFb cho kết quả tổng hợp IAA tốt hơn, hai dòng D1 và D5 cho kết quả cao nhất với nồng độ IAA lần lượt là 3,16 µg/ml và 3,07 µg/ml. - So sánh mức độ tương đồng chuỗi nucleotide 16S rDNA, dòng N12 được xác định là vi khuẩn Achromobacter sp. - Ngày nay, việc tìm ra những nguồn nguyên liệu mới để giải quyết vấn đề an ninh năng lượng cũng như hạn chế ô nhiễm môi trường trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết. - và làm cho môi trường bị ô nhiễm và đặc biệt, ảnh hưởng trực tiếp đến cuộc sống con người cũng như những sinh vật sống trong môi trường.. - Nhằm thay thế cho phân hoá học và tránh gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất, việc sử dụng các loại phân bón sinh học có chứa các giống vi sinh vật có khả năng tiết ra kích thích tố tăng trưởng giúp tăng thể tích và số lượng rễ làm cho cây trồng có khả năng hấp thu tốt chất dinh dưỡng để có thể sinh trưởng và phát triển tốt ngày càng được sử dụng rộng rãi, trong đó kích thích tố IAA (indole acetic acid) đang được mọi người quan tâm.. - Mục tiêu đề tài: Phân lập một số dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm tốt làm tiền đề cho việc sản xuất phân bón vi sinh nhằm tăng năng suất cây trồng.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn. - Dùng cối sứ để nghiền mẫu cho vi khuẩn bên trong mẫu thoát ra ngoài, dùng chày khuấy đều và ép nước mẫu ra.. - Sau đó hút 50 µL dịch vi khuẩn cho vào môi trường bán đặc NFb và Baz. - Ủ 2-3 ngày, đến khi thấy vòng sáng (pellicle) là dấu hiệu sự phát triển của vi khuẩn nội sinh. - Cấy chuyển nhiều lần để tách ròng vi khuẩn. - Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn đã phân lập.. - 2.2.2 Xác định khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995). - Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn đã tách ròng vào môi trường Baz và NFb lỏng, thí nghiệm lặp lại 3 lần.. - Ủ lắc các vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, trùm kín các ống nghiệm để tránh IAA sinh ra bị ánh sáng phân hủy.. - Xây dựng đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 mL photphat buffer được dung dịch IAA stock có nồng độ 160 µg/mL. - Sau đó pha loãng stock bằng photphat buffer để được các nồng độ 0. - Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính ra hàm lượng IAA trong các mẫu vi khuẩn.. - Nguyên tắc: xác định nồng độ NH 4 + nhờ phản ứng giữa phenol và NH 3 dưới sự hiện diện của tác nhân oxy hoá là hypoclorite hình thành phức có màu xanh dưới điều kiện pH kiềm. - Phản ứng này có thể đo được nồng độ từ NH 4 + từ 0,2 đến 12,5 ppm.. - Định lượng NH 4 + do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4 và 6 (sau khi chủng).. - Số liệu đo được về hàm lượng NH 4 + sinh ra từ các dòng vi khuẩn được xử lý bằng phương pháp phân tích Anova và Duncan của phần mềm SPSS 13.0.. - Sau khi phân lập được những dòng vi khuẩn ròng, kiểm tra và khảo sát đặc tính sinh học, chọn ra hai dòng vi khuẩn có đặc tính cố định đạm và tổng hợp IAA tốt, gửi mẫu đến bộ môn Sinh học Phân tử Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ giải trình tự DNA và so sánh tương quan di truyền với các dòng vi khuẩn có trên ngân hàng dữ liệu NCBI.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn. - Từ các mẫu rễ chuối thu được đã phân lập được 43 dòng vi khuẩn trên hai loại môi trường NFb và Baz. - Trong đó có 25 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường NFb và 18 dòng được phân lập từ môi trường Baz. - Các dòng vi khuẩn ròng được ký hiệu lần lượt là D1, D2, D3, D4. - Sau 2 - 3 ngày cấy, đa số các khuẩn lạc của vi khuẩn trên đĩa petri chứa môi trường NFb đặc đều. - có dạng tròn, độ nổi mô, bìa nguyên, và chủ yếu có màu trắng sữa hoặc trắng trong (Hình 1), đường kính trung bình từ 0,5-2 mm tương tự như nghiên cứu của Caceres (1982) về vi khuẩn Azospirillum trên môi trường NFb.. - Hình 1: Khuẩn lạc của vi khuẩn D10 trên môi trường NFb. - Hình 2: Khuẩn lạc của vi khuẩn N8 trên môi trường Baz. - Trên đĩa petri chứa môi trường Baz đặc, sau 2-3 ngày ủ các khuẩn lạc có dạng hình tròn, độ nổi mô, bìa nguyên và có màu trắng hoặc vàng (Hình 2), đường kính trung bình từ 1-1,5 mm.. - Các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NFb đều có chung tính chất là chúng có khả năng làm thay đổi pH của môi trường kéo theo có sự đổi màu của môi trường NFb (nhận biết nhờ sự có mặt của chất chỉ thị màu Bromoethyl Blue).. - Sau khi kiểm tra sự chuyển động bằng phương pháp giọt ép và nhuộm Gram, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập ròng trên cả hai môi trường đều có khả năng chuyển động, thuộc vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que hoặc cầu.. - Trên môi trường NFb, phân lập được 8 dòng vi khuẩn hình cầu có đường kính tế bào biến thiên từ 0,5-2 µm, tế bào vi khuẩn có chiều dài biến thiên từ 1-2,5 µm và chiều rộng biến thiên từ 0,5-2 µm đối với 16 dòng vi khuẩn hình que được trình bày ở Bảng 1.. - Bảng 1: Đặc tính tế bào vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb. - có khả năng chuyển động. - Trên môi trường Baz phân lập được 18 dòng vi khuẩn hình que có chiều dài trong khoảng. - Bảng 2: Đặc tính tế bào vi khuẩn được phân lập trên môi trường Baz. - 3.2 Khả năng tổng hợp NH 4 + trên môi trường NFb. - Dựa vào kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH 4 + của 10 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb, cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng tổng hợp NH 4 + với những lượng khác nhau dao động khá rộng từ 0,22-2,76 ppm.. - Sau khi chủng và ủ ở 30°C trong hai ngày đầu, kết quả thu được là tất cả những dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng tổng hợp NH 4 + với nồng độ từ 1,22-2,31 ppm. - Ở hai ngày tiếp theo, lượng NH 4 + được tổng hợp tiếp tục tăng và đạt giá trị cao nhất, lượng NH 4 + đo được dao động từ 1,39-2,45 ppm. - Tuy nhiên, sau 6 ngày nuôi cấy, nồng độ NH 4 + giảm khá mạnh lượng NH 4 + thu được từ 0,22-1,41ppm (Hình 3).. - Hình 3: Khả năng tổng hợp NH 4 + của 10 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb 3.3 Khả năng tổng hợp NH 4 + trên môi. - trường Baz. - Đối với 10 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Baz, nhận thấy tất cả các dòng này đều có. - khả năng tổng hợp NH 4 + nhưng thấp hơn so với các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb, ngoại trừ hai dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH 4 + khá cao là N5 và N12 (Hình 4).. - Hình 4: Lượng NH 4 + của 10 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Baz Sau hai ngày nuôi cấy, tất cả 10 dòng vi khuẩn. - đều có khả năng tổng hợp NH 4 + trong môi trường Baz lỏng, hàm lượng NH 4 + từ 0,50 ppm (N1) đến 4,85 ppm (N12). - Vào ngày thứ 4, nồng độ NH 4. - do các dòng vi khuẩn sản sinh ra có gia tăng nhưng không đáng kể so với ngày 2 và đạt nồng độ cao nhất (ngoại trừ 2 dòng N15, N16, có nồng độ NH4 + tăng vào ngày 6), dao động từ 0,67 (N16) đến 3,22 ppm (N12). - Ngày thứ 6, nồng độ NH 4 + giảm so với ngày thứ 4 (ngoại trừ 2 dòng. - N15 và N16 có nồng độ NH 4 + tăng vào ngày 6).. - Hai dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH 4 + cao nhất là N12 (4,85 ppm ngày 2) và N5 (3,16 ppm ngày 4).. - 3.4 Khả năng tổng hợp IAA trên môi trường Baz. - Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA cho thấy cả 10 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Baz đều có khả năng tổng hợp IAA.. - Sau 2 ngày chủng, cả 10 dòng vi khuẩn khảo sát đều sản sinh IAA với nồng độ dao động từ 1,19 µg/mL (N16) đến 2,98 µg/mL (N15). - Trong đó, nồng độ IAA ở dòng N15 đạt giá trị cao nhất (2,98 µg/mL) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở mức độ tin cậy 95%. - Sau đó nồng độ IAA lại tiếp tục tăng ngoại trừ dòng N15 có nồng độ IAA giảm. - Ở ngày 4, nồng độ IAA cao nhất là 2,58 µg/mL (N6) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở độ tin cậy 95%. - ngày thứ 6 nồng độ IAA ở tất cả các dòng giảm rõ rệt và dao động từ 1,04 µg/mL (N18) đến 1,78 µg/mL (N15), hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến lượng IAA sinh ra. - Nồng độ IAA ở cả 10 dòng vi khuẩn lại tiếp tục giảm ở ngày 8. - Như vậy, dòng vi khuẩn N15 và N6 đạt nồng độ IAA cao nhất lần lượt vào ngày 2 và ngày 4, kết quả này khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở độ tin cậy 95%.. - Hình 5: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Baz 3.5 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi. - khuẩn được phân lập trên môi trường NFb Đối với 10 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NFb, nhận thấy rằng cả 10 dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp IAA với nồng độ cao hơn các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Baz.. - Sau 2 ngày nuôi cấy, tất cả 10 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp IAA trong môi trường NFb lỏng với nồng độ dao động từ 1,49 µg/mL (D12) đến 3,07 µg/mL (D5). - Ở ngày 4, nồng độ. - IAA do các dòng vi khuẩn sản sinh ra tăng đáng kể so với ngày 2 và đạt nồng độ cao nhất trong tất cả các ngày khảo sát ngoại trừ dòng D5. - Cụ thể nồng độ IAA cao nhất ở dòng D1 (3,16 µg/mL) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở mức độ tin cậy 95%. - Tiếp theo là các dòng D21, D5 và D19 với nồng độ IAA lần lượt là 2,83 µg/mL, 2,77 µg/mL và 2,53 µg/mL. - Nồng độ IAA ở tất cả các dòng vi khuẩn giảm đáng kể ở ngày 6 và ngày 8 tương tự như kết quả ở các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Baz.. - Hình 6: Lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NFb. - Dựa vào biểu đồ nồng độ IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NFb cho thấy nồng độ IAA sinh tổng hợp bởi dòng D1 ở ngày 4 và D5 ở ngày 2 là cao nhất và lần lượt đạt 3,16 µg/mL và 3,07 µg/mL. - Dựa vào kết quả định danh vi khuẩn thì dòng D1 tương đồng với dòng Pseudomonas aeruginosa. - Trong một nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của L - tryptophan lên khả năng tổng hợp IAA của P.aeruginosa thì dòng P.aeruginosa có thể tổng hợp được IAA với nồng độ là 0,2 µg/mL, 0,7 µg/mL, 3,8 µg/mL và 8,3 µg/mL khi có sự hiện diện của L-tryptophan với nồng độ lần lượt là 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL và 500 µg/mL (Karnwal, 2009). - Từ đó cho thấy nồng độ IAA do dòng D1 tổng hợp được cao hơn trong nghiên cứu này mặc dù không sử dụng L-tryptophan trong môi trường nuôi dưỡng.. - 3.6 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S RDNA. - Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt ITS1 và ITS4 (White et al., 1990) để giải trình tự hai dòng vi khuẩn N12 và D1 có hoạt tính cao.. - ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) Dòng vi khuẩn N12 thể hiện khả năng cố định đạm cao nhất qua thí nghiệm khảo sát được xác định là dòng vi khuẩn Achromobacter sp. - được mô tả là nhóm vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que và được biết đến là một trong những loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm. - phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thường được tìm thấy trong môi trường đất ẩm, được tìm thấy nội sinh trong cây Prosopis strombulifera, một loài cây thuộc họ đậu ở Argentina (Sgroy et al., 2009) và trên lúa gạo (Sun et al., 2008. - Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn này còn có khả năng kiểm soát của một số tác nhân gây bệnh thực vật (Vaidya et al., 2001), kích thích sự phát triển của thực vật, và ức chế sản xuất afflatoxin trong Aspergillus sp. - Dòng vi khuẩn D1 qua thí nghiệm khảo sát được đánh giá là dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao nhất. - dòng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa đã được đăng ký trong ngân hàng Gene NCBI có ký hiệu là JX284233.1.. - Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, có hình que, di chuyển bằng một chiên mao đơn cực và sống trong điều kiện hiếu khí tuyệt đối. - Loài vi khuẩn này phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30-37 0 C. - aeruginosa có khả năng tổng hợp IAA một loại kích thích tố thực vật, kích thích sự phát triển của rễ (Khare và Arora, 2010), bên cạnh đó, vi khuẩn này còn thể hiện khả năng hòa tan dạng lân khó tan và kháng nấm gây bệnh trên rễ chuối (Ayyadurai et al., 2006). - Aeruginosa có khả năng được ứng dụng để sản xuất phân bón vi sinh.. - Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. - Phân lập và nhận diện các dòng Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. - Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây bắp