- PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHAT TỪ CHẤT THẢI TRẠI NUÔI BÒ SỮA,. - CHẤT THẢI SỮA VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI. - Từ 13 mẫu chất thải từ trại nuôi bò sữa, trạm thu mua sữa bò, nhà máy sữa, phân lập được 48 dòng vi khuẩn, trong đó có 15/48 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy polyphosphate (poly-P). - Hai dòng vi khuẩn LV1 (-5,98 ppm) và LV8b (11,61 ppm) có khả năng tích lũy poly-P cao. - Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA của 2 dòng vi khuẩn LV1 và LV8b cho thấy dòng LV1 có tỉ lệ tương đồng với vi khuẩn Arthrobacter protophormiae 16S rDNA và Arthrobacter sp. - M1T8B14 16S rDNA là 100% và dòng LV8b có mức tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng PPB7 MB7 16S rDNA, dòng PPB5 16S rDNA, dòng S rDNA là 100%. - Ứng dụng hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b vào trong xử lý nước thải nhân tạo có hàm lượng PO 4 3- [orthophosphate] ban đầu từ 9 ÷ 11 mg/l, dòng LV1 làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 1,11 mg/l, dòng LV8b làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 3,42 mg/l, hai dòng kết hợp làm giảm hàm lượng PO 4 3-. - xuống còn 2,38 mg/l sau 3 ngày xử lý.. - Từ khóa: nước thải sữa, orthophosphate, phân lập, poly-P, vi khuẩn tích lũy polyphosphate. - Hiện nay, tốc độ đô thị hóa nhanh cùng với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực chăn nuôi, các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, chế biến các sản phẩm sinh học…tạo ra số lượng lớn chất thải rắn, nước thải. - Các chất thải, nước thải đưa ra môi trường sẽ gây ảnh hưởng xấu đến môi trường sống. - Trong chất thải, nước thải có rất nhiều thành phần như polysaccharide, các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ, photpho,…trong đó, photpho đã được nhận ra là phân tử cơ bản của sự sống, quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của tảo và các loại thực vật nước trên các dòng sông, các hồ và các vịnh nông gần bờ. - Dòng thải photpho xuất phát từ nước thải đô thị và nước thải công nghiệp đưa vào trong nguồn nước bề mặt làm tăng thêm quá trình phú dưỡng ở các hồ, ao…làm giảm lượng oxy trong nước ảnh hưởng xấu đến đời sống của động vật nước, làm giảm giá trị sử dụng của nước (Oldham et al., 2002. - Người ta có thể loại bỏ photpho trong các dòng nước thải có thể bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp sinh học hoặc kết hợp phương pháp hóa học với sinh học. - Các phương pháp hóa học có nhược điểm là chi phí cao do sử dụng nhiều hóa chất, tăng lượng bùn thải, hóa chất còn sót lại trong dòng thải sau xử lý có thể gây ô nhiễm thứ cấp (Jiang et al., 2004). - Hiện nay, biện pháp hữu hiệu nhất để xử lí nước thải nói chung và khử photpho ra khỏi nước thải nói riêng là biện pháp sinh học vì biện pháp sinh học hiệu quả cao và triệt để hơn so với biện pháp hóa học, đồng thời không gây tái ô nhiễm môi trường, ngoài ra chi phí đầu tư ít nhất (Chu Thị Thơm et al., 2006). - Do đó vấn đề sử dụng vi sinh vật có ích trong tự nhiên, đặc biệt là vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P và nghiên cứu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường nước và biện pháp sinh học thường dựa vào sự tích lũy photpho nội bào của vi khuẩn sẽ làm cho lân hòa tan [orthophotphat] trong môi trường giảm và chuyển hóa thành lân khó tan [poly-P].. - Vì vậy việc nghiên cứu, phân lập, nhận diện và ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-P vào trong xử lý nước thải là rất cần thiết trong tình hình hiện nay.. - 2.2 Phân lập và kiểm tra khả năng tích lũy poly-P của các dòng vi khuẩn Quá trình phân lập vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002). - Lấy các dòng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu chất thải trên môi trường tối thiểu (Sikorski et al., 2002) đem cấy trên môi trường khử lân (Wang et al g/l glucose. - Sau đó, chọn những dòng có khả năng phát triển. - trên môi trường khử lân và cấy chuyền nhiều lần từ các khuẩn lạc riêng lẻ để tách dòng (làm thuần) các dòng (chủng) vi khuẩn trên môi trường tương ứng. - Để kiểm tra nhanh khả năng hình thành poly-P của các dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường khử lân, các dòng vi khuẩn này được cấy trên môi trường lân khó tan (Nautiyal, 1999) với chất chỉ thị pH (Bromothymol blue 0,5. - Đồng thời để kiểm tra sự hình thành poly-P của các dòng vi khuẩn này, các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường khử lân (lỏng) trong 15 ngày trên máy lắc xoay vòng, sau đó tiến hành đo hàm lượng poly-P trong dung dịch vi khuẩn tại phòng thí nghiệm Chuyên Sâu, trường Đại Học Cần Thơ (Cao Ngọc Điệp et al., 2010). - Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn (đối chứng âm).. - 2.3 Nhận diện các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P bằng kỹ thuật PCR. - Chọn 2 dòng vi khuẩn vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P (1 dòng có kết quả đo poly-P cao nhất, 1 dòng có kết quả đo poly-P thấp nhất) để nhân mật số trên môi trường LB (Maniatis et al., 1982), DNA vi khuẩn được trích theo qui trình của Neumann et al. - Giải trình tự đoạn DNA bằng máy giải trình tự tự động ABI 3130 với một trong hai mồi trên, so sánh trình tự trên ngân hàng dữ liệu (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bằng chương trình BLAST N để xác định mức độ đồng hình của các dòng vi khuẩn.. - 2.4 Ứng dụng hai dòng có khả năng tích lũy poly-P cao vào trong xử lý nước thải. - Nuôi nhân mật số hai dòng đã chọn [trình bày ở phần trên] trong môi trường BM/NO 3 - (Su et al., 2001) đến khi đạt được mật số tương đối đồng đều là CFU/ml (khoảng 48 giờ), sau đó ly tâm lạnh và lấy sinh khối chuyển sang môi trường tối thiểu (Sikorski et al., 2002) nhân nuôi tiếp 24 giờ nữa. - Tiến hành bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tích lũy poly-P của các dòng này trên môi trường nước thải nhân tạo (Wang et al., 2008) được điều chỉnh nồng độ PO 4 3- khoảng 9 - 11 mg/l chứa trong các keo nhựa [có dung tích 5-L], liều lượng vi khuẩn sử dụng là 5% (kết hợp hai dòng vi khuẩn thì mỗi dòng sẽ chủng 2,5. - Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại ở điều kiện nhiệt độ tự nhiên của phòng thí nghiệm, các nghiệm thức có chủng vi khuẩn được sục khí để tạo điều kiện hiếu khí xen kẽ kỵ khí, nghiệm thức đối chứng không sục khí, thời gian sục khí 2 giờ/ngày, lưu lượng khí trên mỗi bình khoảng 10 lít/phút. - Xác định các thông số như hàm lượng PO 4 3. - mật số vi khuẩn trong nước thải, hàm lượng poly-P trong môi trường (đo hàm lượng poly-P tại phòng thí nghiệm Chuyên Sâu, trường Đại Học Cần Thơ).. - 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn và kiểm tra khả năng tích lũy poly-P. - Phân lập được 48 dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu từ 13 mẫu chất thải, đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc hình tròn, mô, bìa nguyên, màu trắng sữa hay trong, vi khuẩn có hình dạng que ngắn, chuyển động chậm. - năng phát triển của 48 dòng vi khuẩn này trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân và môi trường lân khó tan nhằm tìm ra các dòng có khả năng tích lũy poly-P thể hiện trên bảng 1.. - Bảng 1: Tổng hợp kết quả khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân và trên môi trường lân khó tan. - (A) Dòng được chọn khi kiểm tra trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân. - (B) Dòng được chọn khi kiểm tra trên môi trường lân khó tan. - TT Dòng vi. - được chọn TT Dòng vi. - Hình 1: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường tối thiểu. - Sau khi kiểm tra, chọn được 15 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P (PR4, PR5, PR6, PL1a, PL3a, PL6a, LV1, LV5, LV8b, OM6, BT3, BT12, SL5, SL8, TR3) (Bảng 2), đa số các dòng vi khuẩn phát triển chậm (36 giờ), khuẩn lạc vi khuẩn tròn, nhỏ, mô, bìa nguyên, màu trắng sữa hay trong, vi khuẩn có hình dạng que ngắn, chuyển động chậm (Bảng 2). - Có 04/15 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P tương đối cao trong môi trường gồm LV8b (11,61 ppm), PR5 (10,36 ppm), SL5 (10,10 ppm) và OM6 (10,00 ppm) (so với đối chứng âm). - 06/15 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P cao hơn so với đối chứng âm (SL8, PR6, PR4, BT3, PL1a, LV5). - và lượng poly-P trong môi trường của 05/15 dòng vi khuẩn (LV1, BT12, PL3a, PL6a, TR3) thấp hơn đối chứng âm (hình thành poly-P trong nội bào vi khuẩn, Cao Ngọc Điệp et al., (2010. - Chọn hai dòng vi khuẩn LV8b (poly-P cao nhất) và LV1 (poly-P thấp nhất) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo sau.. - Bảng 2: Sự tích lũy poly-P của 15 dòng vi khuẩn trong môi trường Số. - poly-P (ppm) Số TT Dòng vi khuẩn. - 3.2 Nhận diện các dòng vi khuẩn LV1 và LV8b có khả năng tích lũy poly-P cao. - Hình 2: Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b. - Hình 2 cho thấy Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b. - dòng LV8b có mức tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng PPB7 MB7 16S rDNA, dòng PPB5 16S rDNA, dòng S rDNA là 100%.. - 3.3 Khả năng chuyển hóa PO 4 3- trong nước thải nhân tạo của hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b. - 3.3.1 Khả năng chuyển hóa PO 4 3- trong điều kiện sục khí 2 giờ/ngày. - Kết quả trên hình 3 cho thấy: Hàm lượng PO 4 3- trong các mẫu nước thải giảm dần theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các dòng vi khuẩn LV1, LV8b và kết hợp LV1 với LV8b vào nước thải để xử lý. - Sau 3 ngày xử lý, hàm lượng PO 4 3-. - trong nước thải <. - Đối với dòng LV1: Qua 2 ngày xử lý thì hàm lượng PO 4 3- đã đạt tiêu chuẩn nước thải loại A (<. - Tốc độ chuyển hóa PO 4 3- trong nước thải xảy ra nhanh nhất vào khoảng thời gian 24 giờ đến 46 giờ (hàm lượng PO 4 3 giảm từ 7,57 mg/l xuống còn 2,67 mg/l), sau đó hàm lượng PO 4 3- vẫn tiếp tục giảm dần theo thời gian, từ mẫu nước thải ban đầu có hàm lượng PO 4 3- là 11,86 mg/l sau 3 ngày xử lý với dòng LV1 thì hàm lượng PO 4 3- chỉ còn ở mức 1,11 mg/l.. - So với dòng vi khuẩn LV1, tốc độ chuyển hóa PO 4 3- trong nước thải của dòng vi khuẩn LV8b yếu hơn. - Tuy nhiên, dòng LV8b vẫn có thể chuyển hóa PO 4 3- trong nước thải, hàm lượng PO 4 3- trong nước thải đạt tiêu chuẩn nước thải loại B (<. - 6 mg/l) sau 2 ngày xử lý và đạt tiêu chuẩn nước thải loại A sau 3 ngày. - Cụ thể, sau 2 ngày xử lý, từ nước thải ban đầu có hàm lượng PO 4 3- là 11,58 mg/l giảm xuống chỉ còn 4,19 mg/l (đạt loại tiêu chuẩn nước thải loại B), đến ngày thứ 3 thì dòng LV8b làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 3,42 mg/l (đạt tiêu chuẩn nước thải loại A).. - Sự kết hợp hai dòng LV1 và LV8b cho kết quả tương đối tốt, từ nước thải ban đầu với hàm lượng PO 4 3- là 11,5 mg/l, sau 1 ngày xử lý đã đạt nước thải loại B (5,6 mg/l) và sau 2 ngày thì đạt nước thải loại A (3,61 mg/l). - Tuy nhiên, sự kết hợp không mang lại kết quả đột biến khi giá trị về hàm lượng PO 4 3- của nghiệm thức kết hợp từ ngày thứ 2 trở về sau gần như nằm giữa giá trị về hàm lượng PO 4 3- của hai nghiệm thức LV1 và LV8b. - Sự kết hợp giữa hai dòng có thể mang lại hiệu quả cao khi mục tiêu xử lý chỉ cần đạt tiêu chuẩn nước thải loại B và không có nhiều thời gian để xử lý. - Lúc đó chỉ cần 1 ngày để xử lý và cho ra nước thải loại B.. - Kết quả trên Hình 4 cho thấy: Mật số vi khuẩn ở các nghiệm thức được chủng dịch vi khuẩn vào thời điểm ban đầu trong khoảng log 10 CFU/ml, riêng nghiệm thức đối chứng 4,63 log 10 CFU/ml. - Mật số vi khuẩn của cả 4 nghiệm thức đều tăng qua từng ngày. - 3.3.2 So sánh khả năng chuyển hóa PO 4 3- trong điều kiện không sục khí và có sục khí (2 ngày/giờ). - Việc sục khí đối với dòng vi khuẩn LV1 mang lại hiệu quả cao: Không có sục khí thì nước thải đạt tiêu chuẩn nước thải loại B sau 2 - 3 ngày xử lý, có sục khí thì nước thải đạt tiêu chuẩn nước thải loại A sau 2 ngày xử lý (Hình 5).. - Tương tự dòng LV1, đối với dòng vi khuẩn LV8b: Trong trường hợp có sục khí thì hiệu quả chuyển hóa PO 4 3- tốt hơn, hàm lượng PO 4 3- giảm nhanh hơn. - Cụ thể, sau 3 ngày xử lý: nước thải đạt tiêu chuẩn loại A (có sục khí), tiêu chuẩn loại B (không sục khí) (Hình 6).. - Đối với hai dòng kết hợp thì hiệu quả của việc sục khí vẫn tương tự. - Cụ thể: không sục khí thì sau 2, 3 ngày đạt được tiêu chuẩn loại B, trong khi đó có sục khí thì chỉ sau 1 ngày xử lý đã đạt tiêu chuẩn loại B và sau 2, 3 ngày thì đạt tiêu chuẩn loại A (Hình 7).. - Hình 4: Sự biến động mật số vi khuẩn theo thời gian (log 10 CFU/ml) trong điều kiện có sục khí 2 giờ/ngày. - Hình 3: Khả năng chuyển hóa PO 4 3- trong nước thải của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trong điều kiện sục khí 2 giờ/ngày. - Hình 5: Khả năng chuyển hóa PO 4 3- của dòng vi khuẩn LV1. - Hình 6: Khả năng chuyển hóa PO 4 3- của dòng vi khuẩn LV8b. - Tác dụng của việc sục khí đến mật số vi khuẩn: Các nghiệm thức có sục khí thì mật số vi khuẩn sẽ tăng lên theo thời gian, nếu không có sục khí thì mật số vi khuẩn chỉ tăng nhanh trong ngày đầu tiên sau đó có dấu hiệu tăng chậm hơn và thậm chí còn giảm xuống, điều này có thể giải thích vì khi sục khí sẽ giúp vi khuẩn tiếp xúc với chất dinh dưỡng dễ dàng hơn, vi khuẩn phát triển tốt hơn (Hình 8).. - 3.3.3 Kết quả định lượng poly-P trong nước thải sau xử lý. - Tiến hành định lượng poly-P trong các mẫu nước thải nhân tạo sau 3 ngày xử lý có sục khí. - Nghiệm thức Hàm lượng poly-P (mg/l). - Bảng 3 cho thấy cả hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b đều có khả năng tích lũy lượng poly-P cao trong môi trường, 3 nghiệm thức có chủng vi khuẩn vào nước thải có hàm lượng poly-P gần tương đương nhau và cao hơn nhiều so với nghiệm thức đối chứng (sở dĩ hàm lượng poly-P của các nghiệm thức vi khuẩn cao hơn nghiệm thức đối chứng do các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P từ ortho- phosphate trong môi trường và lượng poly-P có trong tế bào vi khuẩn). - Điều này chứng tỏ cả hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b đều có khả năng tích lũy poly-P mạnh, có thể ứng dụng vào thực tiễn xử lý nước thải. - Trong đó, dòng LV1 là dòng tốt hơn và rất có tiềm năng trong việc xử lý những nguồn nước thải giàu photpho.. - Phân lập được 48 dòng vi khuẩn từ 13 mẫu chất thải trên môi trường tối thiểu. - Có 15/48 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P. - Hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b. - Hình 8: Ảnh hưởng của quá trình sục khí lên mật số vi khuẩn. - Hình 7: Khả năng chuyển hóa PO 4 3- của hai dòng vi khuẩn LV1 + LV8b. - có khả năng tích lũy poly-P cao. - M1T8B14 16 SrDNA là 100% và dòng LV8b có mức tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng PPB7 MB7 16S rDNA, dòng PPB5 16S rDNA, dòng S rDNAlà 100%. - Ứng dụng hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b vào trong xử lý nước thải nhân tạo có hàm lượng PO 4 3- ban đầu từ 9 ÷ 11 mg/l, dòng LV1 làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 1,11 mg/l, dòng LV8b làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 3,42 mg/l, hai dòng kết hợp làm giảm hàm lượng PO 4 3- xuống còn 2,37 mg/l sau 3 ngày xử lý.. - Phân lập và nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P trong nước rỉ rác. - Cải Tạo Môi Trường Bằng Chế Phẩm Vi Sinh Vật, Nxb Lao Động.