- VI KHUẨN KEO TỤ SINH HỌC TRONG AO NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH TRÀ VINH. - Hoạt tính sinh học, hữu cơ lơ lửng, keo tụ sinh học, khí độc, nuôi trồng thuỷ sản. - The flocculating rate of 22 Gram positive isolates with kaolin suspension showed that MS 9.4 had the strongest flocculating rate (75,83. - MS 9.4 isolate was identified by the 16S-rRNA sequencing and biological test. - The biochemical characteristics of MS 9.4 were similar to Bacillus subtilis, while 16S-rRNA gene sequence of MS 9.4 strain was 100% similar to Bacillus subtilis IAM12118, so MS 9.4 was identified as Bacillus subtilis. - Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Trà Vinh, đã phân lập được 57 chủng vi khuẩn, trong đó có 39 chủng vi khuẩn Gram dương và 18 chủng vi khuẩn Gram âm. - Sau khi sàng lọc sơ bộ bằng phương pháp nhuộm Gram và nhuộm bào tử đã chọn được 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử trong đó có 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn. - Khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn Gram dương với cơ chất là dịch kaolin cho thấy rằng chủng MS 9.4 có tỷ lệ keo tụ cao nhất (75,83. - Chủng vi khuẩn này được định danh bằng phương giải trình tự gen 16S-rRNA và các chỉ tiêu sinh hoá. - Các đặc điểm sinh hóa của chủng MS9.4 tương đồng với loài Bacillus subtilis, đồng thời chủng MS 9.4 có trình tự gen 16S-rRNA tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis IAM12118 nên chủng MS 9.4 được định danh là Bacillus subtilis MS 9.4. - Chủng này có khả năng chịu mặn (7. - Phân lập, sàng lọc và khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn keo tụ sinh học trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Trà Vinh. - và sinh học (sử dụng chế phẩm sinh học – probiotic) và một trong những phương pháp mới là sử dụng vi sinh vật keo tụ sinh học (Kasan et al., 2015).. - Hợp chất keo tụ là sản phẩm được hình thành trong quá trình phát triển của vi khuẩn, nấm, tảo (Desouky et al., 2008). - Vi khuẩn sản xuất chất keo tụ sinh học là những loài vi khuẩn có thể sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp các hợp chất đa phân tử trong tế bào dưới sự hoạt động của các enzyme đặc biệt, sau đó chúng có thể được bài tiết ra ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn, các hợp chất này có khả năng tạo sự kết tụ với các chất khác nhau và tạo thành một khối nhầy lắng xuống dưới đáy. - Chính vì thế, vi khuẩn keo tụ giúp giảm các hợp chất hữu cơ lơ lửng trong nước một cách đáng kể, giúp ổn định chất lượng nước ao nuôi (Luo et al., 2016).. - Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học cao sẽ mở ra một giải pháp mới để xử lý nguồn chất hữu cơ lơ lửng trong nước đồng thời xử lý một số khí độc trong ao nuôi là điều hết sức cần thiết. - Mục tiêu của nghiên cứu này là tiến hành phân lập, sàng lọc và xác định một số yếu tố ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn keo. - 2.3 Phân lập vi khuẩn. - Các chủng vi khuẩn này được định danh sơ bộ bằng nhuộm Gram và bào tử.. - Các chủng vi khuẩn được nhuộm Gram như sau:. - Các chủng được nhuộm bào tử như sau: tạo vết bôi vi khuẩn trên lame rồi đặt lame lên miếng giấy lọc trên cốc nước đun sôi. - Cho dung dịch malachite green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút, sau đó, vết bôi được rửa bằng nước cất trong khoảng thời gian 30 giây. - 2.4 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học. - Đánh giá khả năng sinh các hợp chất keo tụ sinh học theo phương pháp của Luo et al. - Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường Trypticase soya broth (TSB) bổ sung NaCl nồng độ 15 g/l ở nhiệt độ phòng trong điều kiện lắc (150 vòng/phút) trong 24 giờ. - Sau đó cấy vi khuẩn đã hoạt hóa vào. - Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng thay chủng vi khuẩn bằng nước cất vô trùng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. - Tỷ lệ keo tụ. - 2.5 Định danh vi khuẩn. - Chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ mạnh sẽ được định danh bằng các thử nghiệm sinh hoá bao gồm: thử nghiệm catalase, Voges – Proskauer, khả năng tăng trưởng trong môi trường Nutrient broth (NB) ở nhiệt độ 50 0 C và 60 0 C, tăng trưởng trong môi trường 7% NaCl, thử nghiệm nitrate hoá, khả năng thuỷ phân tinh bột và phân huỷ casein. - 2.6 Đánh giá khả năng chịu mặn, chịu pH và chịu muối mật của chủng vi khuẩn. - Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB + 1,5% NaCl ở 30 0 C trong 24 giờ. - Tiến hành đánh giá khả năng chịu mặn của vi khuẩn trong môi trường TSB có bổ sung NaCl với nồng độ từ và 8% trong các thời điểm và 120 giờ. - khả năng chịu pH của vi khuẩn trong môi trường TSB có pH 1, 2, 3, 4. - Tại mỗi thời điểm khảo sát tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn.. - 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ nguồn nước ao nuôi. - Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm, sau khi phân lập và tuyển chọn trên môi trường Trypticase soya agar (TSA) có bổ sung NaCl 1,5% đã thu được 57 chủng vi khuẩn. - Trong 57 chủng vi khuẩn được phân lập có 18 chủng phân lập được từ 4 nguồn nước các ao đang trong quá trình nuôi và 39 chủng được phân lập từ 9 ao nuôi sau quá trình nuôi. - Tiến hành định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn được phân lập, nhận thấy rằng trong 57 chủng có 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, 17 chủng Gram dương, không sinh bào tử và 18 Gram âm.. - Mục tiêu của nghiên cứu là tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và sinh bào tử, vì thế 22 chủng vi khuẩn Gram dương sinh bào tử được sử dụng để tuyển chọn hoạt tính keo tụ sinh học, được trình bày ở Bảng 1.. - Bảng1: Hình thái khuẩn lạc của 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử. - MS 1.1 Tròn, lồi, trong suốt, rìa đều, bóng, đường kính <. - MS 6.2 Tròn, lồi, bóng, rìa đều, trắng trong, tâm hồng, đường kính >. - MS 1.2 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa đều, bóng, đường kính ≥ 2mm. - MS 7.1 Tròn, lồi, bóng, trắng đục, tâm màu da, rìa đều, đường kính >. - MS 1.4 Tròn, lồi, bóng, vàng, rìa đều, đường kính ≥ 0,5 mm Hình que. - MS 7.2 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa phân thùy, đường kính >. - MS 2.1 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa đều, tâm vàng nhạt, đường kính ≥ 2mm Hình que. - MS 8.2 Tròn, dẹt, không bóng, trắng trong, rìa răng cưa, đường kính ≈ 0,5mm Hình que. - MS 2.2 Tròn, lồi, bóng, trắng trong, rìa đều, đường kính ≤ 0,5mm. - MS 4.1 Tròn, lồi, bóng, trắng đục, rìa đều, đường kính >. - MS 9.4 Tròn, rìa đều, trắng trong, lồi, tâm trắng đục, đường kính ≈ 5mm Hình que. - MS 4.2 Tròn, lồi, bóng, trắng trong, rìa đều, đường kính >. - Tròn, lồi, màu trắng đục, rìa đều, có tâm, đường kính ≈ 5mm. - MS 4.3 Tròn, rìa phân thùy, dẹt, trắng đục, đường kính >. - Tròn, rìa đều, trắng đục, lồi, đường kính ≈ 0,5mm. - Tròn, dẹt, rìa răng cưa, trắng đục, nhám, đường kính ≈ 5mm Hình que. - MS 5.4 Tròn, dẹt, đen, rìa răng cưa, trắng đục, đường kính >. - Tròn, dẹt, trắng đục, rìa răng cưa, đường kính ≥ 2mm. - thu MS 6.1 Tròn, lồi, bóng, rìa răng cưa, trắng. - sữa, đường kính >. - 45,61% đến 69,15%, và tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng MS 2.2. - Nhóm 2 gồm 18 chủng được phân lập từ 9 ao đang trong quá trình nghỉ có tỷ lệ keo tụ từ 23,67% đến 75,82% và tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng MS 9.4. - Hình dạng tế bào vi khuẩn, 4 chủng vi khuẩn hình cầu (MS 1.1. - MS 10.1) có tỷ lệ keo tụ từ 45,61% đến 69,15% (tỷ lệ keo tụ cao nhất là chủng MS 2.2) trong khi đó 18 chủng vi khuẩn hình que có tỷ lệ keo tụ sinh học từ 28,33% đến 75,82% (tỷ lệ keo tụ cao nhất là chủng. - Như vậy, từ kết quả khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, chủng MS 9.4 có tỷ lệ keo tụ cao nhất là 75,82%. - Chủng MS 9.4 có những đặc điểm khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường Nutrient agar (NA) trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ phòng như sau: tròn, rìa đều, trắng trong tâm trắng đục, có đường kính xấp xỉ 5mm thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử và được phân lập từ ao nuôi đang trong giai đoạn nghỉ.. - Hình 1: Kết quả sàng lọc hoạt tính keo tụ của 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử Kết quả nghiên cứu của Luo et al. - 48 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ mẫu nước ao nuôi cá chép tại tỉnh Hắc Long Giang, Trung Quốc, trong đó chủng Bacillus megaterium SP1 cho tỷ lệ keo tụ sinh học cao nhất trong số 48 chủng khảo sát là 91%. - So với đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của Bacillus megaterium SP1, chủng MS 9.4 có những đặc điểm tương đồng, vì thế, chủng MS 9.4 đã được tiến hành định danh.. - 3.3 Kết quả định danh chủng vi khuẩn MS 9.4. - Chủng vi khuẩn MS 9.4 được định danh bằng các thử nghiệm sinh hoá và giải trình tự 16s-rRNA.. - Các đặc điểm sinh hoá của MS 9.4 được trình bày ở Bảng 2.. - Kết quả định danh sinh hóa của chủng MS 9.4 cho thấy chủng này thuộc loài Bacillus subtilis.. - Vi khuẩn Bacillus. - subtilis Chủng MS 9.4 Hình thái khuẩn lạc Tròn, nhăn,. - Chủng vi khuẩn. - Các thử nghiệm sinh hóa cho thấy chủng vi khuẩn MS 9.4 có các kết quả sinh hóa tương đồng với B. - Đồng thời, kết quả giải trình tự 16S-rRNA cho thấy chủng MS 9.4 tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis IAMI2118 nên chủng MS 9.4 được định danh là Bacillus subtilis MS 9.4.. - subtilis MS 9.4 được trình bày ở Bảng 3. - subtilis MS 9.4 không chịu được pH 1,0 do mật độ của tế bào đã giảm đáng kể sau 4 giờ nuôi cấy. - Ở pH 2,0, vi khuẩn B. - subtilis MS 9.4 chỉ có thể chịu được tới 2 giờ, nhưng sau đó mật độ tế bào lại giảm. - subtilis MS 9.4 có khả năng chịu được và duy trì tốt mật độ sau 4 giờ nuôi cấy. - subtilis B20.1 thì khả năng chịu pH của chủng Bacillus subtilis MS 9.4 tốt hơn.. - Bảng 3: Kết quả đo OD600nm của vi khuẩn B.. - subtilis MS 9.4 ở các giá trị pH khác nhau. - Giá trị pH Thời gian 1 2 3 4 0 giờ giờ giờ giờ giờ Bảng 4: Kết quả đo OD 600nm của vi khuẩn B.. - subtilis MS 9.4 ở các nồng độ muối mật khác nhau. - 0 giờ giờ giờ giờ giờ Bảng 5: Kết quả đo OD 600nm của vi khuẩn B. - subtilis MS 9.4 ở các nồng độ NaCl khác nhau. - Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật cho thấy chủng Bacillus subtilis MS 9.4 có khả năng chịu được muối mật trong các nghiệm thức khảo sát.. - Mặc dù ở thời điểm 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ mật độ vi khuẩn có giảm nhưng lại tăng lên vào thời điểm 4 giờ, điều này có thể do muối mật là tác nhân ức chế rất mạnh đối với vi khuẩn Gram dương nên trong thời gian đầu nuôi cấy thì vi khuẩn Bacillus subtilis MS 9.4 bị kiềm hãm. - Thời điểm 4 giờ thì vi khuẩn thích nghi và bắt đầu tăng trưởng trở lại. - Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn cho thấy, chủng Bacillus subtilis MS 9.4 có thể sống sót và phát triển mạnh ở tất cả các nồng độ muối khảo sát đế thời điểm 96 giờ. - Sau 120 giờ thì mật độ Bacillus subtilis MS 9.4 ở nồng độ 8% đã giảm đáng kể. - subtilis MS 9.4 lại có thể chịu được nồng độ muối tới 8%.. - Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm thu từ Trà Vinh đã phân lập được 57 chủng vi khuẩn, sau khi sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học và định danh đã xác định đó là vi khuẩn B. - Chủng này có hoạt tính keo tụ sinh học tốt nhất đồng thời có khả năng chịu pH thấp, muối mật và chịu mặn cao