- PHÂN LẬP THỰC KHUẨN THỂ TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY DƯỢC LIỆU CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Ralstonia solanacearum. - Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ khác nhau và được xếp thứ hai trong danh sách các tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất trên cây trồng. - Thực khuẩn thể ký sinh và ức chế vi khuẩn và sử dụng thực khuẩn thể được xem là biện pháp sinh học tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh héo xanh. - Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập các dòng thực khuẩn thể từ đất trồng cây dược liệu có khả năng ly giải vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây trồng. - Thực khuẩn thể được phân lập từ đất và khảo sát vết tan dựa vào phương pháp agar 2 lớp. - Ba mươi lăm dòng thực khuẩn thể có khả năng ức chế vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã được phân lập từ mẫu đất trồng cây dược liệu như cây gừng (Zingiber officinale), nghệ (Curcuma longa L. - Kết quả đánh giá phổ ký chủ của các dòng thực khuẩn thể phân lập cho thấy có 29 dòng thực khuẩn thể tạo vết tan rõ ràng đối với 9 dòng vi khuẩn gây bệnh Ralstonia solanacearum. - Đặc biệt 7 dòng thực khuẩn thể ký hiệu ɸG7, ɸG8, ɸDL3, ɸDL6, ɸH6, ɸH23 và ɸH24 có khả năng ly giải vi khuẩn hơn 72 giờ trong điều kiện phòng thí nghiệm.. - Phân lập thực khuẩn thể từ đất trồng cây dược liệu có khả năng ức chế vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - solanacearum) là tác nhân gây bệnh héo xanh trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ khác nhau, vi khuẩn gây hại trên nhiều loài cây trồng như cà chua, khoai tây, ớt, lạc, chuối,… (Hayward, 2000). - Vi khuẩn R. - Bệnh do vi khuẩn R.. - solanacearum gây ra rất khó phòng trị và gây tổn thất nặng nề do vi khuẩn có phạm vi ký chủ rộng và lưu tồn lâu trong đất (Nguyễn Tất Thắng và ctv., 2011). - Việc sử dụng biện pháp sinh học bằng thực khuẩn thể có đặc tính ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh được coi là sự lựa chọn phù hợp.. - Trong nông nghiệp, TKT được áp dụng trong việc phòng trừ vi khuẩn Erwinia amylovora trên cây đào (Schnabel and Jones, 2001), vi khuẩn R. - Có nhiều nghiên cứu về thực khuẩn ký sinh trên vi khuẩn gây bệnh trên thực vật, trong đó nổi bật với những nghiên cứu về việc kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn R.. - Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu sử dụng TKT trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên cây trồng như Nguyễn Thị Trúc Giang (2014) đã phân lập TKT có khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Nghiên cứu phân lập TKT phân giải vi khuẩn Escherchia coli gây bệnh tiêu chảy ở gà Mai Huỳnh Dư An (2016). - Nghiên cứu đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae (Phan Quốc Huy, 2016). - Trần Hưng Minh (2016) tiến hành phân lập và bước đầu đánh giá hiệu quả của TKT trong phòng trừ bệnh thối gốc lúa do vi khuẩn Erwinia chrysanthemi.. - Yuan and Gao (2016) thực hiện ba nghiên cứu về TKT phân lập từ vùng rễ cây gừng có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus pumilus gây bệnh thối rễ gừng. - Các nghiên cứu về ứng dụng TKT để ức chế vi khuẩn cho đến nay vẫn còn hạn chế do TKT là một loại virus nên yếu tố về an toàn sinh học đặt lên hàng đầu. - Chính vì vậy, nghiên cứu phân lập TKT từ đất trồng cây dược liệu có khả năng ức chế vi khuẩn R.. - Nguồn TKT phân lập từ các mẫu đất trồng cây dược liệu (gừng, nghệ, húng chanh và đinh lăng) thu tại nhà vườn một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (thành phố Cần Thơ, các tỉnh Sóc Trăng và Vĩnh Long).. - Nguồn vi khuẩn: 9 dòng R. - Solanacearum được phân lập từ cây bị bệnh héo xanh đánh số từ. - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và thực khuẩn King’s B (Shurtleff and Averre, 1997) gồm có pepton, K 2 HPO 4 .3H 2 O, MgSO 4 .7H 2 O, agar, nước cất, chuẩn độ pH 7,0 – 7,2.. - 2.2 Phân lập thực khuẩn thể. - Hỗn hợp gồm dung dịch TKT thô, vi khuẩn R. - 2.3 Khảo sát phổ ký chủ của các dòng thực khuẩn thể. - Đĩa petri môi trường King’s B 1,7% được kẻ ô và đánh số, cho vào đĩa hỗn hợp gồm 3 mL môi trường King’s B 0,5% agar và 1 mL huyền phù từng dòng vi khuẩn R. - solanacearum (OD trên tất cả 9 dòng vi khuẩn và phơi đĩa 15-20 phút. - 2.4 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn R.. - Trộn 200 µL TKT (10 8 PFU/mL) và 200 µL dịch huyền phù vi khuẩn R. - đương mật số vi khuẩn sống là 5,47x10 5 CFU/mL) vào 3 mL môi trường King’s B 0,5% agar. - 2.4.2 So sánh số lượng khuẩn lạc của dòng vi khuẩn R. - Nghiên cứu được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại và sử dụng phương pháp trải đếm để đánh giá phần trăm vi khuẩn R. - Huyền phù vi khuẩn được pha loãng đến 10 -6 . - Đĩa thứ 2: trải 50 µL hỗn hợp huyền phù vi khuẩn và 10 µL thực khuẩn thể trên môi trường King’s B 1,7% agar. - Đĩa được ủ ở 28 o C và tiến hành đếm số khuẩn lạc của vi khuẩn xuất hiện sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.. - 3.1 Phân lập các dòng thực khuẩn thể từ đất trồng cây dược liệu ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - Trong đó, 13 dòng TKT được phân lập từ vùng đất trồng gừng (phage gừng: ɸG) và 5 dòng được phân lập từ đất vùng rễ của cây nghệ (phage Nghệ: ɸN) ở thành phố Cần Thơ và tỉnh Sóc Trăng. - Từ mẫu đất vùng rễ cây húng chanh ở địa bàn thành phố Cần Thơ và tỉnh Vĩnh Long phân lập được 11 dòng TKT (phage Húng chanh: ɸH) có khả năng ức chế vi khuẩn R. - Tương tự, có 6 dòng TKT được phân lập từ đất trồng cây đinh lăng (phage đinh lăng: ɸĐL).. - (2015) đã phân lập được 6 dòng TKT hiệu quả trong việc kiểm soát vi khuẩn R. - Theo Wommack and Colwell (2000) TKT có thể tìm thấy chủ yếu ở những nơi có vi khuẩn tồn tại bao gồm cả đất và mẫu cây bệnh. - (2016) nghiên cứu về TKT phân lập từ vùng rễ cây gừng có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus pumilus gây bệnh thối rễ gừng. - Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về TKT được phân lập từ đất vùng rễ cây đinh lăng. - Ngoài ra, một số nghiên cứu về vi sinh vật được phân lập từ các cây cùng họ Araliaceae cũng. - (2017) cho thấy đã phân lập được tổng cộng 89 dòng nấm nội sinh từ rễ, thân, lá và hạt của Panax notoginseng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thối rễ.. - Bảng 1: Các dòng TKT được phân lập từ đất trồng cây dược liệu ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - 3.2 Khảo sát phổ ký chủ và đánh giá khả năng ức chế của TKT trên vi khuẩn R.. - Trong số 35 dòng TKT phân lập được chỉ có 6 dòng TKT thể hiện hoạt động ức chế vi khuẩn gây bệnh rất yếu vì xuất hiện vết tan mờ và không ổn định trong quá trình phân lập. - Do đó, 29 dòng TKT còn lại cho vết tan rõ ràng và ổn định được lựa chọn để khảo sát phổ ký chủ dựa trên 9 dòng vi khuẩn R.. - solanacearum và kết quả được trình bày ở Bảng 2 cho thấy nhóm TKT được phân lập từ gừng và nghệ có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mạnh hơn cho vết tan rõ ràng. - ɸG7 và ɸG8 (Hình 1A) có khả năng ức chế vi khuẩn và ly giải hết toàn bộ bề mặt vi khuẩn trên đĩa và ức chế được 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn ký chủ.. - Tương tự, cả 6 dòng TKT phân lập từ đất trồng đinh lăng đều cho vết tan rõ ràng thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn khá tốt (Hình 1B), trong đó hai dòng TKT ký hiệu ɸDL3 và ɸDL6 có khả năng xâm nhiễm được 3 dòng vi khuẩn gây bệnh. - Bốn dòng TKT ký hiệu ɸDL1, ɸDL2, ɸDL4 và ɸDL5 có khả năng xâm nhiễm được 2 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm. - Nhóm TKT phân lập được từ đất trồng cây Húng chanh cũng cho vết tan rõ ràng, thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn mạnh (Hình 1C) và có phổ ký chủ gần giống nhau.. - Hình 1: Khả năng lây nhiễm và phổ ký chủ của thực khuẩn thể phân lập từ đất trồng gừng và nghệ (A). - dòng vi khuẩn gây bệnh R. - solanacearum được khảo sát dòng vi khuẩn ký hiệu RS10 nhạy cảm nhất với TKT vì có đến 29 trong tổng số 29 TKT có khả năng. - xâm nhiễm và ức chế dòng vi khuẩn này, tiếp đến là dòng vi khuẩn ký hiệu RS5 bị xâm nhiễm bởi 18 trong tổng số 29 TKT thử nghiệm, dòng vi khuẩn RS2 bị xâm nhiễm bởi 16 trong tổng số 29 TKT và dòng RS3 là dòng ít mẫn cảm nhất với TKT vì chỉ có 1 trong tổng số 29 TKT thử nghiệm có khả năng xâm nhiễm được dòng vi khuẩn này. - Kutateladze and Adamia (2010) cho thấy TKT là 1 loài kí sinh rất chuyên biệt lên 1 loài vi khuẩn hoặc vài dòng trong cùng một loài. - Trong nhóm TKT phân lập từ đất trồng gừng dòng TKT ký hiệu ɸG7 và ɸG8 có phổ ký chủ rộng nhất, thông qua việc xâm nhiễm 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm.. - Trong nhóm TKT phân lập từ đất trồng húng chanh các dòng TKT ký hiệu ɸH6, ɸH20, ɸH21, ɸH22, ɸH23 và ɸH24 có phổ ký chủ khá rộng, có khả năng xâm nhiễm 5 trong tổng số 9 kí chủ. - Bảng 2: Phổ kí chủ của 29 dòng TKT được phân lập từ đất trồng cây dược liệu. - STT TKT Mã vi khuẩn Số dòng. - Ghi chú: dấu + là TKT xâm nhiễm vi khuẩn và dấu – là TKT không xâm nhiễm vi khuẩn Kết quả phổ ký chủ cho thấy trong 9 dòng vi. - nhiều dòng vi khuẩn với mức độ mạnh yếu khác nhau thể hiện qua vết tan rõ hay mờ và mỗi dòng TKT chỉ có 1 ký chủ chính. - 3.3 Khả năng phân giải vi khuẩn R.. - solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả về phổ ký chủ TKT xác định được RS10 và RS2 là 2 dòng vi khuẩn ký chủ chính của 7 dòng TKT cho hiệu quả phân giải mạnh nhất. - Thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải vi khuẩn gây bệnh của. - Đường kính vết tan thể hiện khả năng phân giải hoàn toàn hay không hoàn toàn và khả năng kháng lại của vi khuẩn đối với TKT trong điều kiện phòng thí nghiệm.. - Bảng 3: Đường kính vết tan tạo bởi các dòng TKT khi xâm nhiễm vi khuẩn R. - STT Vi khuẩn TKT Đường kính vết tan. - Kết quả khảo sát đường kính vết tan của 7 dòng TKT đối với 2 dòng vi khuẩn gây bệnh sau 72 giờ thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3 cho thấy đường kính vết tan của 7 dòng TKT thử nghiệm có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. - Đường kính vết tan của hai dòng TKT ký hiệu ɸG7 và ɸG8 đối với dòng vi khuẩn RS10 có chiều hướng tăng lên sau 48 giờ. - Hai dòng thực khuẩn thể ɸDL3 và ɸDL6, đường kính vết tan đối với dòng vi khuẩn RS10 ở thời điểm 24 giờ lần lượt đạt 3,13 và 2,93 mm. - Kết quả trên cho thấy trên cùng một dòng vi khuẩn là RS10, 4 dòng thực khuẩn ɸG7, ɸG8, ɸDL3 và ɸDL6 cho hiệu quả phân giải vi khuẩn mạnh và ổn định. - Ngược lại, kích thước vết tan có chiều hướng giảm theo thời gian thí nghiệm đối với 3 dòng TKT ɸH6, ɸH23 và ɸH24 trên ký chủ là vi khuẩn RS2. - (2009) đã phân lập được 132 dòng thực khuẩn từ nước cống có khả năng kiểm soát vi khuẩn R. - solanacearum và 5 dòng thực khuẩn kiểm soát vi khuẩn Erwinia chrysanthemi nhưng các dòng. - Đường kính vết tan có chiều hướng gia tăng và tạo thành đường viền mờ bên ngoài vết tan có thể được giải thích là do sự phân giải vi khuẩn gây bệnh của enzyme được tiết ra từ TKT nhằm phá hủy màng tế bào vi khuẩn gây bệnh (Cisek et al., 2017). - Kết quả này cũng phù hợp với Nguyễn Minh Tâm (2015) đã phân lập TKT từ mẫu bệnh héo xanh trên dưa leo và đường kính vết tan của 5 dòng TKT phân lập có khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh R. - 3.4 Số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn RS10 trong điều kiện có và không chủng hai dòng thực khuẩn ɸG7 và ɸG8. - Kết quả so sánh số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn RS10 trong điều kiện có và không chủng thực khuẩn thể ɸG7 và ɸG8 với 3 lần lặp lại cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về mật số vi khuẩn giữa hai nghiệm thức có và không chủng thực khuẩn thể. - Nghiệm thức đối chứng là vi khuẩn RS10 không chủng TKT có mật số vi khuẩn đạt 92 khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa đếm trải tương đương với mật số 1840x10 6 CFU/mL, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 2 nghiệm thức có chủng TKT ɸG7 và ɸG8, lần lượt là 4 và 5 khuẩn lạc trên đĩa đếm trải tương đương với mật số 80 x10 6 CFU/mL và 100 x10 6 CFU/mL cho thấy có sự giảm rõ rệt về mật số của vi khuẩn khi có chủng TKT. - Hình 2 cho thấy sự khác biệt rõ về mật số khuẩn lạc của vi khuẩn RS10 giữa nghiệm thức đối chứng không chủng TKT (Hình 2A và 2C) với nghiệm thức chủng TKT ɸG7 và ɸG8 (Hình 2B và 2D).. - Thông qua các chỉ tiêu đường kính vết tan 7 dòng TKT ɸG7, ɸG8, ɸDL3, ɸDL6 trên ký chủ RS10 và ɸH6, ɸH23, ɸH24 trên ký chủ RS2 qua các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ và so sánh mật số vi khuẩn trên môi trường có và không có chủng hai dòng TKT ɸG7 và ɸG8 cho kết quả ức chế vi khuẩn. - (2013) đã phân lập được dòng TKT ký hiệu HMPM-2012 có khả năng ức chế vi khuẩn R. - Hình 2: Mật số vi khuẩn RS10 ở nghiệm thức không chủng TKT (A và C) và ở nghiệm thức có chủng thực khuẩn thể G7 (B) và G8 (D). - Các mẫu đất trồng cây dược liệu như gừng, nghệ, đinh lăng và húng chanh ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long phân lập được 35 dòng thực khuẩn thể, trong đó có 29 dòng TKT có khả năng ly giải vi khuẩn R. - Đặc biệt, khả năng ức chế vi khuẩn của 2 dòng TKT ɸG7 và ɸG8 có sự khác biệt có ý nghĩa đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh khi không có và có chủng thực khuẩn. - Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng thực khuẩn thể được phân lập từ đất trồng cây dược liệu có triển vọng để ứng dụng cho việc quản lý và điều trị bệnh héo xanh trên cây trồng do vi khuẩn R.. - nghiệm khả năng phân giải vi khuẩn Escherichia coli của thực khuẩn thể (Bacteriophage) phân lập tại các trại gà thương phẩm. - Phân lập và khảo sát hiệu quả phòng trị của thực khuẩn thể đối với bệnh héo xanh dưa leo do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện in vitro và nhà lưới. - Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại cây khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ.. - Đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae. - Phân lập và bước đầu đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh thối gốc lúa do vi khuẩn Erwinia chrysanthemi