Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phòng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG TRONG ĐẤT CÓ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỊ BỆNH.
- THỐI CỦ HÀNH TÍM DO VI KHUẨN Pseudomonas aeruginosa Nguyễn Thị Mai Trinh, Trương Tố Quyên và Nguyễn Đắc Khoa.
- Bacillus safensis, Bacillus stratosphericus, hành tím, Pseudomonas aeruginosa, thối củ, vi khuẩn đối kháng Keywords:.
- Thối củ do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại năng suất và chất lượng hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
- Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập, tuyển chọn và định danh được các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phòng trị bệnh.
- Trong số 133 chủng vi khuẩn phân lập được từ đất ruộng hành tại thị xã Vĩnh Châu, bốn chủng 2C, 3A, 3B và 4A có khả năng đối kháng với vi khuẩn P.
- Chủng 3B có khả năng đối kháng mạnh nhất với bán kính vòng vô khuẩn là 6 mm.
- Trong điều kiện nhà lưới, các nghiệm thức áo củ với huyền phù 10 8 CFU/mL của hai chủng vi khuẩn 3B và 4A và chủng vào đất với huyền phù vi khuẩn 4A (10 8 CFU/mL) và 3B (10 9 CFU/mL) có hiệu quả giúp giảm bệnh thối củ, hiệu quả này duy trì đến thời điểm 12 ngày sau chủng bệnh.
- Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn cho thấy chủng 3B là Bacillus safensis và chủng 4A là Bacillus stratosphericus..
- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phòng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
- IFAD, 2013), vi khuẩn Erwinia carotovora (Võ Hoàng Nghiệm, 2012.
- IFAD, 2013) và vi khuẩn Pseudomonas aegurinosa (Nguyễn Thị Nguyệt, 2014.
- Trong đó, vi khuẩn P.
- Phòng trừ sinh học bệnh cây bằng vi khuẩn đối kháng với mầm bệnh được xem là biện pháp hiệu quả và bền vững, thân thiện với môi trường và an toàn cho sức khỏe con người.
- Tại Đồng bằng Sông Cửu Long, sử dụng vi khuẩn đối kháng trong đất có nguồn gốc bản địa là hướng phòng trừ bệnh cây tiềm năng và cho kết quả cao trong phòng trị bệnh trên nhiều loại cây trồng như bệnh cháy bìa lá lúa (Võ Thị Phương Trang, 2013.
- Nghiên cứu này được hiện nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phòng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P.
- Vi khuẩn P.
- 2.2 Phân lập vi khuẩn trong đất.
- Sau 48 giờ nuôi cấy, chọn các khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái khác nhau trên bề mặt môi trường NA để cấy chuyển sang sang môi trường NA mới cho đến khi ròng.
- Các chủng vi khuẩn được bảo quản trong glycerol 15%.
- 2.3 Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn phân lập từ đất đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên đĩa thạch.
- Trải đều 50 µL huyền phù vi khuẩn P..
- Sau đó, chấm sinh khối khuẩn lạc vi khuẩn phân lập (đã được nuôi cấy 48 giờ trên đĩa thạch NA) lên đĩa NA mới tại 3 điểm cách đều nhau, ủ ở nhiệt độ 28±2 o C trong 48 giờ trong tủ ủ.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau cho mỗi chủng vi khuẩn phân lập.
- Sau khi ủ, tiến hành chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng và đo bán kính vòng vô khuẩn (từ điểm ngoài cùng khuẩn lạc đến vị trí điểm lan cuối cùng của vòng vô khuẩn).
- Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng được sử dụng các cho thí nghiệm tiếp theo..
- 2.4 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối kháng.
- Chuẩn bị đĩa môi trường có trải vi khuẩn P..
- Các chủng vi khuẩn đối kháng được nuôi trong 10 mL môi trường nutrient broth (NB) (môi trường NA không bổ sung agar).
- Tại thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau nuôi cấy, lấy 1 mL huyền phù vi khuẩn và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong.
- 15 phút để được dịch nuôi cấy không có tế bào vi khuẩn (gọi tắt là dịch nuôi cấy).
- Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau.
- 2.5 Khảo sát khả năng làm giảm bệnh thối củ hành tím của vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức, gồm 3 nhân tố (1) chủng vi khuẩn đối kháng được tuyển chọn từ Mục 2.3 và 2.4, (2) mật số vi khuẩn đối kháng và 10 7 CFU/mL) và (3) phương pháp xử lý vi khuẩn đối kháng (chủng vào đất và áo củ).
- Các chủng vi khuẩn đối kháng được nuôi trên môi trường NA trong 48 giờ và pha loãng với nước cất vô trùng để đạt mật số và 10 7 CFU/mL..
- Nghiệm thức chủng vào đất, mỗi chậu được tưới đều với 5 mL huyền phù vi khuẩn đối kháng đã được chuẩn bị trước tương ứng với các nồng độ vi khuẩn khác nhau tại thời điểm 24 giờ trước khi trồng..
- Nghiệm thức áo củ, hành giống được áo với huyền phù vi khuẩn đối kháng trong 1 giờ trước khi trồng vào đất..
- Củ hành được chủng bệnh bằng cách tạo vết thương sâu khoảng 5 mm xung quanh cổ củ và bơm 500 µL huyền phù vi khuẩn P.
- 2.6 Định danh vi khuẩn đối kháng.
- Vi khuẩn đối kháng được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s (Holt et al., 1994).
- chủng vi khuẩn đối kháng được giải trình tự tại Công ty Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank trên NCBI bằng công cụ Blastn để tìm ra các chủng vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA tương đồng.
- Sau đó, dựa vào sự khác nhau về đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn này như thành tế bào – nhuộm Gram (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006), khả năng sinh nội bào tử (Schaeffer and Fulton, 1933), khả năng di động (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2007), khả năng tổng hợp enzyme catalase (McLeod et al., 1923), khả năng chịu nhiệt (phát triển được ở nhiệt độ 45 o C), sự mẫn cảm đối với các loại kháng sinh như ampicillin và lincomycin (Nguyễn Thanh Hà, 1991) để định danh vi khuẩn..
- 3.1 Khả năng đối kháng của huyền phù và dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phân lập từ đất.
- Các chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc phổ biến là tròn, rìa có khía hoặc không khía, màu trắng trong hoặc trắng đục, kích thước không đồng đều..
- Trong các chủng vi khuẩn được phân lập, có 4 chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B và 4A) có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn P.
- Trong đó, chủng 3B có khả năng đối kháng cao nhất (bán kính vòng vô khuẩn = 6 mm).
- Ở thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế mầm bệnh bằng dịch tế bào cho thấy chỉ có dịch nuôi cấy của hai chủng 2C và 4A có khả năng ức chế vi khuẩn P.
- Dựa vào kết quả này, hai chủng vi khuẩn 3B và 4A được tuyển chọn để khảo sát khả năng làm giảm bệnh thối củ trong điều kiện nhà lưới..
- 3.2 Hiệu quả giảm bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới.
- Hiệu quả làm giảm bệnh thối củ hành tím của hai chủng vi khuẩn 3B và 4A được thực hiện bằng hai phương pháp xử lý gồm áo củ và chủng vào đất với 3 mật số và 10 7 CFU/mL.
- Kết quả khảo sát hiệu quả giảm bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P..
- aegurinosa của hai chủng vi khuẩn 4A và 3B trong điều kiện nhà lưới được trình bày trong Bảng 1.
- nghiệm thức áo củ với vi khuẩn đối kháng đều cho hiệu quả làm giảm bệnh thối củ, mức độ bệnh ở các nghiệm thức này dao động từ 5-95%, mặc dù vẫn cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng dương (dao động từ 1,00- 1,67.
- Trong đó, áo củ với chủng vi khuẩn 3B ở mật số 10 8 CFU/mL cho hiệu quả giảm bệnh cao nhất.
- Ở tất cả các nghiệm thức chủng vi khuẩn bằng phương pháp áo củ, hiệu quả giảm bệnh kéo dài đến thời điểm 12 NSCB ngoại trừ nghiệm thức áo củ với chủng vi khuẩn 4A ở mật số 10 7 CFU/mL chỉ cho hiệu quả giảm bệnh đến thời điểm 8 NSCB.
- Đối với phương pháp chủng vi khuẩn đối kháng vào đất, chỉ có nghiệm thức xử lý với chủng vi khuẩn 4A ở mật số 10 8 CFU/mL và 3B ở mật số 10 9 và 10 7 CFU/mL có hiệu quả giảm bệnh và kéo.
- Trong đó, nghiệm thức với chủng vi khuẩn 3B ở mật số 10 9 CFU/mL cho hiệu quả giảm bệnh cao nhất đến 12 NSCB với mức độ bệnh thối củ là 49,33%.
- Theo các tiêu chí đặt ra gồm hiệu quả giảm bệnh cao và kéo dài cùng với mật số huyền phù vi khuẩn thấp, các nghiệm thức áo củ với chủng 4A và 3B ở mật số 10 8 CFU/mL và chủng vào đất với 4A ở mật số 10 8 CFU/mL và 3B ở mật số 10 9 CFU/mL là các nghiệm thức có tiềm năng cao nhất được tuyển chọn để triển khai nghiên cứu khảo sát khả năng phòng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P.
- Bảng 1: Hiệu quả làm giảm bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aegurinosa gây ra của hai chủng 4A và 3B trong điều kiện nhà lưới tại thời điểm 4, 8 và 12 NSCB.
- vi khuẩn Mật số (CFU/mL).
- 3.3 Định danh vi khuẩn đối kháng.
- Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn 4A (1.418 nucleotide) và 3B (1.431 nucleotide) được so sánh với trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn khác trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI)..
- subtilis (JQ039972.1)] và trình tự gen của chủng 4A có độ tương đồng 99% với trình tự gen của 5 loài vi khuẩn trong chi Bacillus [B.
- Vì đều có độ tương đồng bằng nhau, hai chủng vi khuẩn tiếp tục được khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa để xác định tên loài..
- Chủng vi khuẩn 3B là vi khuẩn Gram dương, hình que (Hình 1A), hiếu khí (phát triển được trên bề mặt môi trường thạch), có khả năng sinh nội bào tử (Hình 1B) và di động (Hình 1C), tổng hợp được enzyme catalase (Hình 1D), có khả năng phát triển ở nhiệt độ 45 o C (Hình 1E) và không có khả năng phân giải tinh bột (Hình 1F).
- Vì vậy, chủng 3B được xác định là vi khuẩn B.
- Hình 1: Các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn 3B..
- Chủng 4A là vi khuẩn Gram dương, hình que (Hình 2A), hiếu khí (phát triển được trên bề mặt môi trường thạch), có khả năng sinh nội bào tử (Hình 2B) và di động (Hình 2D), tổng hợp được enzyme catalase (Hình 2C), không phát triển được ở nhiệt độ 45 o C (Hình 2E), mẫn cảm với kháng sinh ampicillin (Hình 1F) nhưng không mẫn cảm với lincomycin (Hình 2G).
- Vì vậy, chủng 4A được xác định là vi khuẩn B.
- Hình 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn 4A..
- Kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn đều có hiệu quả giảm bệnh thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng dương (sử dụng thuốc hóa học).
- Phòng trừ sinh học bằng vi khuẩn đối kháng là phương pháp thay thế thân thiện với môi trường, giúp giảm chi phí phòng trị bệnh thối củ trong quá trình canh tác và có hiệu quả lâu dài từ phòng bệnh cho đến trị bệnh.
- Bên cạnh, khả năng đối kháng trực tiếp với mầm bệnh, vi khuẩn đối kháng còn có khả năng nhân mật số nhanh, kích thích sinh trưởng và tính kháng bệnh của cây trồng (Kloepper, 1993.
- Trước khi triển khai ngoài đồng, các vi sinh vật đối kháng được xác định loài nhằm loại bỏ các loài có khả năng gây hại đến môi trường, con người, động vật và cây trồng.
- Trong nghiên cứu này, hai chủng vi khuẩn 4A và 3B được định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA, đây là kỹ thuật cho kết quả định danh nhanh hơn so với phương pháp truyền thống (Janda and Abbott, 2002.
- Tuy nhiên, kỹ thuật này có điểm hạn chế là không thể phân biệt các chủng vi khuẩn trong cùng phân nhóm khi chúng có độ tương đồng cao hoặc giống nhau về trình tự gen 16S rRNA.
- So sánh trình tự gen 16S rRNA của 2 chủng 3B và 4A cho thấy chúng có cùng độ tương đồng (99%) với 12 loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus.
- Ngoài ra, dựa vào độ tương đồng cao nhất để định danh vi khuẩn sẽ cho kết quả không chính xác và đáng tin cậy vì gen 16S rRNA chỉ chiếm một phần nhỏ trong bộ gen vi sinh vật (Janda and Abbott, 2002.
- Do đó, bổ sung các khảo sát dựa trên sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn vào quá trình định danh là điều cần thiết, giúp kết quả định danh được chính xác và đáng tin cậy hơn.
- Bằng cách kết hợp phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA với khảo sát sinh lý sinh hóa theo Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s, chủng 3B được định danh là vi khuẩn B.
- safensis và chủng 4A là vi khuẩn B.
- Vi khuẩn B.
- safensis còn có khả năng đối kháng với nhiều mầm bệnh trên nhiều loại cây trồng như Phytopthora capsici trên bí đao (Zhang et al.
- liệu vi khuẩn (microbial fuel cells) (Zhang et al..
- Hiện nay, chưa có các báo cáo đề cập đến khả năng gây hại đến môi trường, con người, động vật và cây trồng của hai loài vi khuẩn này.
- Vì vậy, hai chủng vi khuẩn B.
- Trong 133 chủng vi khuẩn được phân lập từ bốn mẫu đất ruộng hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng, 4 chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B và 4A) có khả năng đối kháng với vi khuẩn P.
- aeruginosa trên đĩa thạch, trong đó chủng 3B có khả năng đối kháng mạnh nhất (bán kính vòng vô khuẩn = 6 mm).
- Bên cạnh đó, chỉ có dịch nuôi cấy của hai chủng 2C và 4A có khả năng ức chế vi khuẩn P.
- Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn cho thấy chủng 3B là B.
- et al., 2013..
- et al., 2013.
- Xác định mầm bệnh gây đốm lá trên hoa hồng tại Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong đất để phòng trị bệnh..
- Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá của vi khuẩn trong đất ở thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang.
- Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong đất để phòng trị bệnh chạy dây trên khoai lang tím tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.
- Xác định mầm bệnh trên hạt lúa giống tại An Giang và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong đất để phòng trị bệnh..
- Xác định mầm bệnh trên hạt lúa giống tại Hậu Giang và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong đất để phòng trị bệnh..
- Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa của vi khuẩn đối kháng trong đất hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng.
- Xác định mầm bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím tại huyện Bình Tân, Vĩnh Long và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong đất để phòng trị bệnh.
- Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá của vi khuẩn trong đất tỉnh An Giang