- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG LÀM GIẢM MÀU MẬT RỈ ĐƯỜNG SAU LÊN MEN CỒN TỪ MỘT SỐ HẠT NGŨ CỐC. - Nghiên cứu nhằm phân lập một số dòng vi khuẩn từ hạt gạo, bắp, mè và đậu nành để giảm màu MRSLM. - Kết quả cho thấy tổng cộng có 39 dòng vi khuẩn phân lập từ 4 loại hạt ngũ cốc. - Trong đó, 10 dòng vi khuẩn phân lập từ hạt gạo và bắp thể hiện khả năng giảm màu MRSLM cao. - Hai dòng vi khuẩn G4 và G5 lần lượt giảm 30% và 25,3% màu MRSLM sau 3 ngày nuôi cấy. - Kết quả khảo sát với 3 chế phẩm chứa riêng lẻ vi khuẩn G4, G5 và cộng đồng vi khuẩn phân lập từ hạt gạo cho thấy sau 2 giai đoạn xử lý, khả năng giảm màu của 3 chế phẩm đều rất cao, lần lượt đạt và 79,5% và cao hơn so với nghiệm thức đối chứng xử lý với nước cất (30. - Kết quả định danh thông qua 16S-rRNA cho thấy 2 dòng vi khuẩn G4 và G5 thuộc chi Enterococcus và có quan hệ gần gũi nhất với loài Enterococcus italicus G4 và Enterococcus italicus G5.. - Phân lập, tuyển chọn và định danh một số dòng vi khuẩn có khả năng làm giảm màu mật rỉ đường sau lên men cồn từ một số hạt ngũ cốc. - Một vài nghiên cứu đã cho thấy một số dòng vi khuẩn kị khí và hiếu khí có khả năng phân hủy màu trong nguồn nước thải này như Lactobacillus hilgardii (Ohmomo et al., 1988), Bacillus sp. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh trong hạt ngũ cốc để giảm màu MRSLM trong nước thải của ngành sản xuất cồn từ mật rỉ đường.. - 2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn. - Môi trường Luria-Bertani (LB) dùng nuôi vi khuẩn cho định danh (Schmidt et al., 2003) gồm 10 g Tryptone, 5 g Yeast extract và 10 g NaCl.. - 2.3.1 Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng giảm màu MRSLM từ hạt ngũ cốc. - Trích vi khuẩn từ hạt ngũ cốc. - Tiến hành thu phần nước chứa vi khuẩn từ hạt ngũ cốc cho vào bình tam giác 500 mL. - đã tách lớp, tiến hành thu cộng đồng vi khuẩn acid lactic (phần dung dịch nằm phía dưới lớp màng sữa).. - Các cộng đồng vi khuẩn sau khi phân lập được nhân nuôi liên tục qua 5 thế hệ nhằm gia tăng mật số vi khuẩn có khả năng giảm màu MRSLM. - Quy trình nhân nuôi được thực hiện bằng cách hút 1 mL dịch cộng đồng vi khuẩn cho vào bình tam giác 100 mL có chứa sẵn 49 mL môi trường MSM lỏng bổ sung 30% MRSLM (v/v) đã được tiệt trùng. - Đây là nguồn vi khuẩn dùng để phân lập.. - Phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn có khả năng giảm màu MRSLM. - Bốn cộng đồng vi khuẩn phân lập từ 4 loại hạt ngũ cốc sau khi gia tăng mật số ở mục a được kiểm tra về khả năng giảm màu MRSLM trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng MSM bổ sung 30%. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn. - Cộng đồng vi khuẩn có khả năng giảm màu tốt được tuyển chọn để bố trí thí nghiệm chọn nồng độ MRSLM thích hợp nhất dùng trong thí nghiệm đánh giá khả năng giảm màu MRSLM.. - 3 , 10 -5 và 10 -7 (hệ số pha loãng 10), sau đó hút 50 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn ở các nồng độ pha. - Các đĩa môi trường TSA chứa vi khuẩn được ủ trong tủ ủ ở nhiệt độ 35 o C trong 3 ngày. - Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn sau khi đã phân lập và làm thuần được mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng như nhuộm Gram vi khuẩn.. - 2.3.2 Đánh giá và so sánh khả năng giảm màu MRSLM của các dòng vi khuẩn phân lập. - Nguồn vi khuẩn. - Các dòng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi trong bình tam giác 100 mL chứa 30 mL dung dịch TSB đã tiệt trùng. - Các bình chứa vi khuẩn được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 100 vòng/phút trong 3 ngày và trong tối. - Sau khi ly tâm, loại bỏ nhanh phần nước ở trên, giữ lại phần sinh khối vi khuẩn bên dưới. - Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại cho mỗi dòng vi khuẩn. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn vào. - vi khuẩn có khả năng khử màu mật rỉ đường trong thời gian nuôi cấy rất ngắn từ 48 – 72 giờ.. - 2.3.3 Xử lý giảm màu MRSLM bằng chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn và cộng đồng vi khuẩn được tuyển chọn. - Tạo chế phẩm vi sinh xử lý màu MRSLM từ các dòng và cộng đồng vi khuẩn. - Dòng vi khuẩn có khả năng giảm màu MRSLM cao nhất chọn từ kết quả khảo sát ở mục 2.3.2 (ít nhất 2 dòng) và cộng đồng vi khuẩn chứa các dòng vi khuẩn này được nhân nuôi để tạo ra các chế phẩm vi sinh lỏng. - Việc lựa chọn các dòng vi khuẩn và cộng đồng vi khuẩn tạo chế phẩm vi sinh nhằm giúp tăng hiệu quả giảm màu MRSLM so với biện pháp xử lý bằng vi khuẩn nhưng không tạo chế phẩm vi sinh.. - 2/ Xử lý bằng chế phẩm vi sinh chứa cộng đồng vi khuẩn. - 3/ Xử lý bằng chế phẩm vi sinh chứa từng dòng vi khuẩn riêng lẻ. - 2.3.4 Định danh các dòng vi khuẩn tuyển chọn bằng sinh học phân tử. - Các dòng vi khuẩn tuyển chọn ở mục 2.3.2 được nuôi riêng trong ống nghiệm chứa môi trường LB và. - Loại bỏ phần nước phía trên, giữ lại phần sinh khối vi khuẩn bên dưới Eppendorf. - Hòa tan sinh khối vi khuẩn với 250 µL dung dịch TE (pH= 8,0). - Sau đó, ly trích DNA của vi khuẩn bằng CTAB 3% theo quy trình của Ihrmark et al. - DNA của hai dòng vi khuẩn được khuếch đại gen 16S-rRNA với cặp mồi được sử dụng là (Weisburg et al F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn trong hạt ngũ cốc có khả năng loại màu MRSLM. - Sau khi đạt được 4 cộng đồng vi khuẩn nội sinh từ 4 loại hạt ngũ cốc gạo, bắp, đậu nành và mè, tiến hành khảo sát khả năng giảm màu của 4 cộng đồng và chọn cộng đồng vi khuẩn thể hiện khả năng giảm màu tốt để phân lập các dòng vi khuẩn giảm màu MRSLM. - Kết quả khảo sát khả năng giảm màu MRSLM của 4 cộng đồng vi khuẩn nội sinh từ 4 loại hạt ngũ cốc trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 30% MRSLM được trình bày ở Hình 1. - Kết quả cho thấy giai đoạn 0 - 4 ngày sau khi nuôi cấy, màu của MRSLM giảm rất nhanh ở tất cả 4 cộng đồng vi khuẩn. - Tuy nhiên, trong giai đoạn 4 – 5 ngày khả năng giảm màu MRSLM của 3 cộng đồng vi khuẩn từ hạt bắp, đậu nành và mè có xu hướng bình ổn, ngoại trừ cộng đồng vi khuẩn gạo. - Khả năng giảm màu MRSLM của cộng đồng vi khuẩn gạo tăng lên đến 14,3% sau 5 ngày nuôi cấy. - Khả năng giảm màu của 4 cộng đồng vi khuẩn khác biệt nhau ý nghĩa thống kê (p<0,05) sau 5 ngày nuôi cấy. - Cộng đồng vi khuẩn bắp có khả năng giảm màu đạt 19,2%, kế đến là cộng đồng vi khuẩn mè và đậu nành lần lượt đạt 6,6% và 4,1%. - Nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn không thể hiện khả năng giảm màu MRSLM (0%) ở các thời điểm thu mẫu. - Do đó, hai cộng đồng vi khuẩn phân lập từ hạt bắp và gạo được chọn để phân lập các dòng vi khuẩn có tiềm năng giảm màu MRSLM. - hấp phụ mạnh trong những ngày đầu của thí nghiệm, khả năng giảm màu tăng khi mật số vi khuẩn tăng lên.. - Hình 1: Khả năng giảm màu MRSLM của 4 cộng đồng vi khuẩn nội sinh từ 4 loại hạt ngũ cốc trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng MSM bổ sung 30% MRSLM sau 5 ngày nuôi cấy. - Trước khi phân lập các dòng vi khuẩn giảm màu MRSLM tốt từ hai cộng đồng vi khuẩn gạo và bắp, tiến hành thí nghiệm khảo sát để chọn nồng độ MRSLM thích hợp dùng bố trí thí nghiệm giảm màu MRSLM của các nghiên cứu tiếp theo. - Diễn biến về khả năng giảm màu MRSLM ở các nồng độ khác nhau trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có xu hướng giống nhau ở hai cộng đồng vi khuẩn thử nghiệm. - lần lượt ở cộng đồng vi khuẩn bắp và cộng đồng vi khuẩn gạo. - cao nhất ở nồng độ 30% và sau đó khi tăng nồng độ MRSLM từ 40 - 50%, tỉ lệ giảm màu MRSLM của hai cộng đồng vi khuẩn lại giảm xuống rất đáng kể (từ 26,9% xuống còn 8,7% và từ 38,7% xuống còn 16% cho lần lượt hai cộng đồng vi khuẩn bắp và gạo) và khác biệt thống kê khi so sánh các nồng độ MRSLM với nhau trong cùng 1 cộng đồng vi khuẩn (p<0,05). - Hình 2: Khả năng giảm màu MRSLM của 2 cộng đồng vi khuẩn bắp và gạo trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng MSM bổ sung các mức nồng độ MRSLM khác nhau sau 5 ngày nuôi cấy. - Hình thái tế bào vi khuẩn dạng hình cầu chiếm tỷ lệ cao nhất 58,9% (23 dòng) trong khi dạng hình que và hình liên cầu lần lượt có tỷ lệ 30,7% (12 dòng) và 10,4%. - Đồng thời, vi khuẩn Gram dương cao hơn vi khuẩn Gram âm và lần lượt đạt 71,7% (28 dòng) và 28,3% (11 dòng) (Hình 3).. - Hình 3: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của hai dòng vi khuẩn đại diện G5 và B16 được phân lập từ hạt gạo và hạt bắp. - 3.2 Đánh giá khả năng giảm màu MRSLM trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng MSM của 39 dòng vi khuẩn phân lập. - Kết quả đánh giá về khả năng giảm màu MRSLM của 39 dòng vi khuẩn trong môi trường MSM bổ sung 30% MRSLM cho thấy, ở thời điểm 3 ngày nuôi cấy thì tỉ lệ giảm màu của các dòng vi khuẩn phân lập từ cộng đồng vi khuẩn bắp và các dòng vi khuẩn phân lập từ cộng đồng vi khuẩn gạo dao động từ 7,5% đến 20% và từ 8% đến 30%. - Từ kết quả của 39 dòng vi khuẩn trên tuyển chọn được 10 dòng đại diện cho khả năng giảm màu cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy và kết quả được trình bày ở Bảng 1. - Kết quả cho thấy khả năng giảm màu của 10 dòng vi khuẩn dao động từ 15% đến 30% sau 3 ngày nuôi cấy và đều khác biệt ý nghĩa thống kê (p<. - Trong đó, dòng vi khuẩn ký hiệu G4 có tỉ lệ giảm màu cao nhất ở thời điểm 2 và 3 ngày thu mẫu, đạt 30% sau 3 ngày nuôi cấy (Hình 4). - Dòng vi khuẩn G5 cũng cho tỉ lệ giảm màu cao và giảm 25,3% màu MRSLM sau 3 ngày nuôi cấy. - Kết quả nghiên cứu này cho thấy vi khuẩn có khả năng làm giảm màu MRSLM trong thời gian ngắn sau 0 - 3 ngày nuôi cấy và kết quả nghiên cứu này tương tự. - Kim và Shoda (1999) cho rằng sử dụng vi khuẩn để loại màu MRSLM sẽ giảm thời gian nuôi cấy và trong môi trường lỏng vi khuẩn phát triển tốt hơn. - Nghiên cứu của Tondee và Sirianltntapiboon (2008) với dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum No. - Ngoài ra, Krzywonos và Seruga (2012) cũng nghiên cứu trên dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum cho thấy khả năng giảm màu mật mía đường của dòng vi khuẩn này sau 4 ngày đạt 27%, 44%, và 35% lần lượt trong môi trường lỏng chứa 30%, 25% và 20% mật rỉ đường.. - Dòng vi khuẩn Lactobacillus hilgardii giảm 28%. - Hình 4: So sánh tỉ lệ làm giảm màu MRSLM của dòng vi khuẩn G4 sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường MSM chứa 30% MRSLM so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. - Bảng 1: Tỉ lệ giảm màu MRSLM của 10 dòng vi khuẩn tiêu biểu nhất trong tổng số 39 dòng thử nghiệm trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng MSM bổ sung 30%. - MRSLM sau 3 ngày nuôi cấy STT Dòng vi khuẩn. - 3.3 Khả năng giảm màu MRSLM bằng chế phẩm vi sinh từ của hai dòng vi khuẩn G4, G5 và cộng đồng vi khuẩn hạt gạo. - Khả năng làm giảm màu MRSLM của 3 chế phẩm vi sinh từ 2 dòng vi khuẩn G4, G5 và cộng đồng vi khuẩn từ hạt gạo qua 5 giai đoạn xử lý được trình bày ở Hình 5. - Ở giai đoạn 2, tất cả các nghiệm thức đều khác biệt thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau, trong đó nghiệm thức xử lý với chế phẩm vi sinh từ cộng đồng vi khuẩn gạo cho hiệu quả giảm màu tốt nhất (79,5. - kế đến là nghiệm thức xử lý với chế phẩm vi sinh từ dòng vi khuẩn G5, G4 và nước lần lượt đạt và 30%, từ đó cho thấy khả năng giảm màu của chế phẩm cộng đồng vi khuẩn gạo hiệu quả hơn so với chế phẩm từng dòng đơn G4 và G5. - Do đó, để đạt hiệu quả giảm màu cao nhất, rút ngắn thời gian xử lý và tiết kiệm chi phí thì nên xử lý màu MRSLM bằng các chế phẩm vi sinh chứa các dòng vi khuẩn loại màu tốt qua hai hoặc ba giai đoạn xử lý. - Ngoài ra, theo nghiên cứu của Kumar và Chandra (2006), khi sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus spp. - giúp làm giảm màu mật rỉ mía đường cao gấp 2 đến 4 lần so với từng dòng vi khuẩn đơn trong nhóm vi khuẩn này.. - Hình 5: Phần trăm giảm màu MRSLM sau 5 giai đoạn xử lý với 3 chế phẩm vi sinh từ cộng đồng vi khuẩn hạt gạo, dòng vi khuẩn G5 và G4. - 3.4 Kết quả giải mã trình tự một đoạn gen 16S rRNA và định danh tên khoa học của hai dòng vi khuẩn G4 và G5 bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho hiệu quả giảm màu MRSLM tốt nhất ký hiệu là G4 và G5 được phân lập từ hạt gạo và đều thuộc vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng hình liên cầu. - Như vậy, hai dòng vi khuẩn có chức năng giảm màu MRSLM này đều thuộc chi Enterococcus và có quan hệ gần gũi nhất với loài Enterococcus italicus G4 và Enterococcus italicus G5, xếp theo bậc phân loại sinh vật từ liên. - Do đó, nghiên cứu này bổ sung vào kiến thức về hai dòng vi khuẩn thuộc chi Enterococcus trong tự nhiên có khả năng giảm màu của MRSLM với hiệu quả cao.. - Tóm tắt kết quả định danh hai dòng vi khuẩn giảm màu MRSLM G4 và G5 TT Dòng Độ đồng. - Các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu. - Định danh Vi khuẩn Số đăng kí. - Vi khuẩn nội sinh từ hạt ngũ cốc đặc biệt từ gạo và bắp chứa các dòng vi khuẩn có chức năng làm giảm màu MRSLM. - Từ bốn mẫu hạt ngũ cốc gồm hạt gạo, bắp, mè và đậu nành đã phân lập được 39 dòng vi khuẩn. - Trong đó, có 6 trong tổng số 19 dòng vi khuẩn phân lập từ gạo và 4 trong tổng số 20 dòng vi khuẩn phân lập từ bắp thể hiện chức năng giảm màu MRSLM cao sau 3 ngày nuôi cấy. - Hai dòng vi khuẩn G4 và G5 được phân lập từ gạo là hai dòng có khả năng giảm màu MRSLM tốt nhất. - Cả ba chế phẩm vi sinh được tạo ra từ hai dòng vi khuẩn G4, G5 và cộng đồng vi khuẩn gạo cho hiệu quả cao trong xử lý làm giảm màu MRSLM ở 2 giai đoạn xử lý đầu tiên so với biện pháp xử lý bằng nước. - Gia tăng tốc độ phân hủy sinh học hoạt chất propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng bằng vi khuẩn Paracoccus sp