- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ NITƠ VÀ PHOTPHO TỪ BÃI RÁC ĐỂ XỬ LÝ N VÀ P TRONG NƯỚC RỈ RÁC Cao Ngọc Điệp 1 và Đoàn Tấn Lực 2. - Ammonium, nước rỉ rác, orthophosphate, vi khuẩn chuyển hoá nitơ, vi khuẩn tích luỹ pophosphate Keywords:. - NO 3 - and mixture of these three kinds of nitrogen anh orthophosphate, three isolates having high N removal ability (TOD1.1, TOD2.3, TND1.4) and three polyphosphate-accumulating bacterial isolates (TL2.3, HP2.3, HP3.2) were chosen to sequence randomly by automatic sequencer. - The results showed that TOD1.1, TOD2.3 and TND1.4 isolates were 99% of identity with JF799886 Enterobacter sp.. - EU884439 Enterobacter sp. - 12 and FJ189785 Enterobacter sp. - with JX025736 Bacillus cereus strain VP11, the HP2.3 and HP3.2 isolates were 99% of identity with JF505965 Exiguobacterium mexicanum strain KNUC9031 and FJ976560 Acinetobacter soli strain LCR52, respectively. - The combined Enterobacter sp. - TNĐ1.4 and Acinetobacter soli HP3.2 reduced the concentrations of ammonium, total N, Nitrite, Nitrate, orthophosphate, total P and the released ammoniac gas to the lowest level after five days of inoculation.. - Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và 52 dòng vi khuẩn tích luỹ polyphosphate được phân lập từ n ước rỉ rác của 5 bãi rác ở V ĩnh Long, Cần Thơvà Hậu Giang. - Khảo sát trên môi trường bổ sung NH 4. - với lượng orthophosphate, 3 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (TOD1.1, TOD2.3, TND1.4 ) và 3 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P (TL2.3, HP2.3, HP3.2) cao được chọn để giải trình tự và sử dụng phần mềm BLAST N để so sánh với các trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu gen của NCBI. - Kết quả cho thấy dòng TOD1.1 đồng hình với JF799886 Enterobacter sp. - CIFRI D-TSB- 9-ZMA và dòng TOD2.3 tương đồng với dòng HQ259961 Klebsiella variicola strain 7 &. - dòng EU884439 Enterobacter sp. - dòng TND1.4 đồng hình với dòng FJ189785 Enterobacter sp.CSB08 đều ở mức 99%. - trong khi dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P TL2.3 tương đồng ở mức 98% với dòng JX025736 Bacillus cereus strain VP11 và hai dòng HP2.3 &HP3.2 đồng hình ở mức độ 99% với dòng JF505965 Exiguobacterium mexicanum strain KNUC9031 và dòng FJ976560 Acinetobacter soli strain LCR52, theo thứtự. - Hỗn hợp hai dòng Enterobacter sp. - TNĐ1.4 và Acinetobacter soli HP3.2 giảm lượng ammonium, TN, Nitrite, Nitrate, orthophosphate và TP trong nước rỉ rác ở mức thấp nhất sau 5 ngày sau khi chủng đồng thời hàm lượng khí ammoniac thải ra thấp nhất.. - mà còn bị ô nhiễm bởi nhiều nguồn khác trong đó, đáng quan tâm nhất là nước rỉ ra từ các bãi rác vì loại nước này có hàm lượng chất ô nhiễm rất cao. - Thành phần nước rỉ rác rất phức tạp trong đó ô nhiễm chất hữu cơ là chủ yếu, bên cạnh còn ô nhiễm chất vô cơ, đặc biệt là một lượng lớn các hợp chất nitơ vô cơ hòa tan (NH 4. - Tuy nhiên, trong nước rỉ rác cũng chứa nhiều chủng loại vi khuẩn chuyển hoá nitơ, vi khuẩn tích luỹ polyphosphate. - rất phong phú và chính những loại vi khuẩn bản địa này nếu được tuyển chọn và ứng dụng để xử lí N và P hoà tan trong nước rỉ rác mang lại hiệu quả cao. - Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ, vi khuẩn tích luỹ polyphosphate tốt để loại bỏ.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi khuẩn. - khắp mặt thạch, ủ trong tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 30 o C trong thời gian 48 giờ (môi trường cho vi khuẩn chuyển hóa nitơ (Zhao et al., 2010) và 72 giờ (môi trường cho vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008). - Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc rời rạc và có hình thái khác nhau trên môi trường phân lập (về hình dạng, màu sắc, kích thước, bìa, độ nổi) mỗi dạng khuẩn lạc cấy chuyển nhiều lần sang môi trường cùng loại đến khi các khuẩn lạc rời ra, đồng nhất và đều nhau trên đường cấy. - Chọn khuẩn lạc rời cấy chuyển vào ống chứa môi trường cùng loại. - Ống đã cấy chuyển được ủ ở 30 o C trong tủ ủ vi sinh vật để vi khuẩn phát triển. - 2.2.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập được Kiểm tra khả năng chuyển hóa nitơ của các dòng vi khuẩn. - Các dòng vi khuẩn phân lập được cấy trên 4 loại môi trường có bổ sung NH4. - Chọn những dòng vi khuẩn phát triển được trên môi trường có bổ sung NH 4 , NO 3 , NO 2 và T (NH 4. - trong đó NH 4 + và NO ở nồng độ 100 mM, NO 2 - ở nồng độ 10 mM để tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng trên môi trường có bổ sung NH 4. - NO 2 và T (NH 4 , NO 3 , NO 2 ) ở nồng độ cao hơn trong đó NH 4 và NO 3 - ở nồng độ tăng dần 200 mM, 300 mM… và NO 2 - ở nồng độ tăng dần 20 mM, 30 mM…. - Kiểm tra khả năng tích luỹ PO 4 3- của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P. - Các dòng vi khuẩn sau khi được kiểm tra ròng tiến hành nuôi trên môi trường lỏng trên máy lắc để kiểm tra khả năng tích lũy poly-P. - Mỗi dòng vi khuẩn được chủng vào 5ml môi trường sau thời gian 4-6 ngày.. - Ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) bằng cách nuôi vi khuẩn trong chai ampicillin chứa 4 ml môi trường tích lũy poly-P, lắc 160 vòng/phút, sau 6 ngày nuôi tiến hành ly tâm 12.000 vòng/phút và trong thời gian 10 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước dịch. - Những dòng vi khuẩn có độ hữu hiệu cao (chuyển hoá đạm và tích luỹ phospho hoà tan cao) được chọn để nhận diện bằng cách thực hiện các phản ứng PCR để xác định gen 16S rRNA theo cặp mồi 8F và 1492R (cho vi khuẩn chuyển hoá nitơ) và 27F và 1492R (cho vi khuẩn tích luỹ poly- P). - (Hàn Quốc), kết quả trình tự được so sánh với dòng vi khuẩn chuẩn ở ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng phần mềm BLAST N để nhận diện dòng vi khuẩn được giải trình tự gen 16S rRNA.. - 2.2.3 Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trong loại bỏ N&P trong nước rỉ rác ở mô hình bình lên men 1L. - Kết hợp 2 dòng vi khuẩn chuyển hoá N và vi khuẩn tích luỹ poly-P trong điều kiện sụt khí để loại bỏ N và P trong nước rỉ rác (có thành phần lí hoá tính trình bày trong Bảng 1) trong mô hình bình lên men (bioreactor 1L) cho đến khi hàm lượng Ammonium và orthophosphate giảm dưới mức loại B1 của QCVN 25 :2009/BTNMT).. - Bảng 1: Thành phần lý hóa tính trong nước rỉ rác tại bãi rác Tân Long, Phụng Hiệp,Hậu Giang pH TKN NH 4. - Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và 52 dòng vi khuẩn tích luỹ polyphosphate được. - phân lập từ 20 mẫu nước rỉ rác của 5 bãi rác Hoà Phú, Trà Ôn (Vĩnh Long), Tân Long (Hậu Giang), Thốt Nốt, Cờ Đỏ (Cần Thơ). - Hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được có đặc điểm que ngắn và có khả năng chuyển động, khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu trắng đục, bìa nguyên, độ nổi mô, kích thước từ 0,4 – 2,5 mm (Hình 1).. - Hình 1: Khuẩn lạc của 2 dòng vi khuẩn TOD1.1 và TL2.3 và hình dạng của dòng TL2.3 (chụp hình ở kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 11.000 lần). - NO 2 - và hỗn hợp 3 loại nitơ (Bảng 2) cùng lượng orthophosphate tích luỹ (Bảng 3), chọn được 3 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (TOD1.1, TOD2.3, TND1.4) và 3 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P (TL2.3, HP2.3, HP3.2) có độ hữu. - hiệu cao vì chúng có khả năng phát triển tốt trên môi trường bổ sung NH 4. - NO 2 - với nồng độ cao cũng như chúng phát triển trên môi trường hỗn hợp 3 loại NH 4. - NO 2 - trong khi đó dòng HP3.2 có hàm lượng tích luỹ PO 4 cao nhất.. - Bảng 2: Ba dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá nitơ cao. - TT Tên dòng vi khuẩn mM NH 4+ mM NO 2- mM NO 3- mM tổng hợp ba. - Bảng 3: Ba dòng vi khuẩn có khả năng tích luỹ polyphosphate cao. - TT Tên dòng vi khuẩn Tổng lượng PO 4 3- (mg/l) Lượng PO 4 tự do (mg/l) Lượng PO 4 tích luỹ (mg/l). - Tất cả 6 dòng vi khuẩn đều được nhận diện ở băng 1500 bp trên phổ điện di của PCR-16S rRNA được nhận lên từ DNA của chúng (Hình 2) và được xác định dòng TOD1.1 đồng hình với JF799886 Enterobacter sp. - CIFRI D-TSB-9-ZMA mức độ 99% và dòng TOD2.3 tương đồng ở mức 99% với dòng HQ259961 Klebsiella variicola strain 7 &. - dòng TND1.4. - đồng hình với dòng FJ189785 Enterobacter sp.. - trong khi dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P TL2.3 tương đồng ở mức 98% với dòng JX025736 Bacillus cereus strain VP11 và hai dòng HP2.3 &. - HP3.2 đồng hình ở mức độ 99% với dòng JF505965 Exiguobacterium mexicanum strain KNUC9031 và dòng FJ976560 Acinetobacter soli strain LCR52, theo thứ tự.. - Hình 2: Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn chuyển hoá N (trái) và vi khuẩn tích luỹ poly-P (phải). - 1, 2 và 3 là 3 dòng vi khuẩn TOD1.1, TOD2.3 và TND1.4. - 4 đến 9 là 3 dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P, 4-5: dòng TL2.3, 6-7: dòng HP2.3 và 8-9: dòng HP3.2 và 10: đối chứng âm. - Từ Hình 3 cho thấy cây phả hệ chia thành 2 nhánh trong đó nhánh 1 bao gồm 2 dòng TN1.4 và TOD1.1 gần với chi Enterobacter sp. - Chủng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích luỹ poly-P vào trong nước rỉ rác có nồng độ ammonium ban đầu là 400 mg/l sau 5 ngày cho thấy hỗn hợp 2 dòng TND1.4 và TL2.3 và hỗn hợp 2 dòng TND1.4 và HP3.2 làm giảm lượng. - ammonium xuống 5,6 và 5,1 mg/l, theo thứ tự (Hình 5) trong khi đó hỗn hợp 2 dòng TND1.4 và HP3.2 giảm lượng orthophosphate liên tục và đạt mức thấp nhất vào ngày thứ 5 (Hình 6), như vậy hỗn hợp 2 dòng chuyển hoá đạm Enterobacter sp. - TND1.4 và dòng tích luỹ polyphosphate Acinetobacter soli HP3.2 hiệu quả nhất trong việc loại bỏ ammonium và orthophosphate trong nước rỉ rác sau 5 ngày chủng vi khuẩn trong mô hình thí nghiệm 1L.. - FJ189785_Enterobacter_sp._CSB08 TN1.4. - EF419181_Enterobacter_sp._mcp11b TOD1.1. - JF799886_Enterobacter_sp._CIFRI_D-TSB-9-ZMA TOD2.3. - HM751200_Klebsiella_pneumoniae_strain_RSN19 HQ259961_Klebsiella_variicola_strain_7 EU884439_Enterobacter_sp._12 100. - Hình 3: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ giữa các dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ dựa trên trình tự 16S rRNA (phương pháp neighbor-joining) với 1000 lặp lại (bootstrap). - Cây phả hệ trình bày mối quan hệ của dòng HP2.3 gần với chi Exiguobacterium và dòng TL2.3. - với chi Acinetobacter và Bacillus (nhánh 1) trong khi đó dòng HP3.2 ở nhánh 2 (Hình 4).. - Hình 4: Cây phả hệ trình bày mối 35 quan hệ giữa các dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P dựa trên trình tự16S rRNA (phương pháp neighbor-joining) với 1000 lặp lại (bootstrap). - Trái lại nước rỉ rác không sục khí (NT1) có lượng khí ammoniac thoát ra ít nhất, điều đặc biệt nước rỉ rác có chủng vi khuẩn chuyển hoá nitơ làm cho khí NH3 thoát ra nhưng ít hơn nghiệm thức 2 (sục khí) và lượng nitơ còn lại được vi khuẩn sử dụng như nguồn dưỡng. - Hỗn hợp 2 dòng dòng chuyển hoá đạm Enterobacter sp. - TND1.4 và dòng tích luỹ polyphosphate Acinetobacter soli HP3.2 có lượng khí ammoniac thải ra ít nhất (Hình 7). - Đặc biệt 2 dòng TOD1.1 và dòng HP3.2 sử dụng nhiều P dễ tan nên khi bổ sung vào thì nghiệm (Hình 6) làm cho lượng P ở ngày 0 thấp hơn các nghiệm thức khác.. - Hình 5: Hiệu quả của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trên hàm lượng ammonium (mg/l) trong nước rỉ rác theo thời gian. - Hình 6: Hiệu quả của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trên hàm lượng orthophosphate (mg/l) trong nước rỉ rác theo thời gian. - Ghi chú: NT1: đối chứng (không sục khí), NT2: đối chứng (sục khí), NT3: dòng TOD1.1 và dòng TL2.3, NT4: dòng TOD1.1 và dòng HP3.2, NT5: dòng TND1.4 và dòng TL2.3, NT6: dòng TND1.4 và dòng HP3.2 [NT3, NT4, NT5, NT6 đều sục khí liên tục]. - Hình 7: Hiệu quả của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trên hàm lượng khí NH3 (mg/l) thoát ra từ nước rỉ rác theo thời gian. - Ghi chú: NT1: đối chứng (không sục khí), NT2: đối chứng (sục khí), NT3: dòng TOD1.1 và dòng TL2.3,NT4: dòng TOD1.1 và dòng HP3.2, NT5: dòng TND1.4 và dòng TL2.3, NT6: dòng TND1.4 và dòng HP3.2 [NT3, NT4, NT5, NT6 đều sục khí liên tục]. - Chủng vi khuẩn chuyển hoá nitơ làm giảm hàm lượng Nitơ tổng (TN) so với đối chứng, sục khí (NT2) giảm được 75,31% trong khi các dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ từ 79,01% đến 90,12%. - (TP) và hỗn hợp các dòng TOD1.1+dòng HP3.2, TND1.4+dòng TL2.3, dòng TND1.4+dòng HP3.2 giảm lượng TP trái lại hàm lượng nitrite và nitrate trong nước rỉ rác quá thấp (Bảng 4).. - Bảng 4: Hiệu quả dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích luỹ poly-P trên hàm lượng TN, TP, Nitrite và Nitrate (mg/l)*. - Nhìn chung hỗn hợp 2 dòng TND1.4+HP3.2 hiệu quả nhất trong việc loại bỏ ammonium, nitrite, nitrate, orthophosphate và TP kế đến 2 dòng TND1.4+dòng TL2.3.. - Xử lý nitơ và photpho trong nước rỉ rác đã được Lê Văn Cát (2007) đề nghị từ lâu bằng phương pháp lí và hoá học ở Việt Nam tuy chưa đạt kết quả mỹ mãn nhưng tác giả cũng đã đề cập đến mối nguy hiểm từ nước rỉ rác giàu nitơ và photpho. - diện và ứng dụng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri để loại bỏ amoni trong nước thải trại heo ở Đài Loan trong điều kiện có oxi (sục khí), chúng tôi cũng đã đề nghị loại bỏ nitơ trong nước rỉ rác giàu hữu cơ bằng vi khuẩn khử đạm vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Acinetobacter lwoffii (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Hoàng Nam), gần đây Cao Ngọc Điệp et al. - (2013) đã ứng dụng hai dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ dị dưỡng Pseudomonas stutzeri D3b và dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Bacillus subtilis DTT001L loại bỏ N và. - P trong nước rỉ rác rất hiệu quả, kết quả của chúng tôi trước đây (Bùi Thế Vinh et al. - 2011) cũng cho thấy dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ Enterobacter sp. - Trong nước rỉ rác chứa nhiều dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong đó có nhiều dòng vi khuẩn có độ hữu hiệu cao.. - Kết hợp hai dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ Enterobacter sp. - TND1.4 và dòng vi khuẩn tích lũy polyphosphate Acinetobacter soli HP3.2 loại bỏ N và P trong nước rỉ rác trong điều kiện sục khí ở mô hình thí nghiệm phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn B1 về ammonium, Tổng N, nitrite, nitrate, orthophosphate, Tổng P của QCVN 24 và QCVN 25: 2009/BTNMT.. - Phân lập và nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy sản xuất sữa. - Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Acinetobacter lwoffii loại bỏ amoni trong nước thải từ rác hữu cơ. - Khả năng loại bỏ nitơ và photpho trong nước rỉ rác của vi khuẩn khử đạm dị dưỡng và vi khuẩn tích luỹ polyphotphat