Phân lập và nhận diện vi tảo dị dưỡng thraustochytrid sản xuất carotenoid

- PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI TẢO DỊ DƯỠNG THRAUSTOCHYTRID SẢN XUẤT CAROTENOID.
- 1 Viện Nghiên cứu &.
- Aurantiochytrium sp., Carotenoid,.
- Thraustochytrid, vi tảo biển dị dưỡng, xác định trình tự.
- Aurantiochytrium sp., carotenoid, heterotrophic microalga, sequencing, Thraustochytrid.
- Trong những năm gần đây, sự gia tăng nhu cầu sử dụng carotenoid từ các nguồn tự nhiên đã thúc đẩy nhiều nỗ lực lớn để cải thiện sản xuất carotenoid từ các nguồn sinh học, do đó mở ra cơ hội phát triển vi tảo..
- Trong nghiên cứu này, một loại vi tảo biển dị dưỡng, dòng BCM05 có khả năng sản xuất carotenoid đã được phân lập thành công từ các mẫu lá bần đang trong giai đoạn phân hủy ở rừng ngập mặn của tỉnh Cà Mau.
- Xác định trọng lượng khô sinh khối tế bào là một tiến trình mất nhiều thời gian, do đó một đường chuẩn cho sự tương quan giữa trọng lượng sinh khối khô với mật độ quang của dòng BCM05 đã được xây dựng.
- Hàm lượng carotenoid tổng số của dòng BCM05 là 7.600µg/kg trọng lượng khô.
- Kết quả phân tích trình tự một phần vùng gen 18S rRNA của dòng BCM05 đã cho thấy có 97% đồng hình với trình tự của loài Aurantiochytrium sp.
- Qua phân tích cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.05 và sử dụng giá trị bootstrap cao với 1.000 lần lặp lại, dòng BCM05 đã được xác định và được đặt tên là Aurantiochytrium sp.
- Dòng vi tảo này có thể được xem là nguồn vi tảo tiềm năng để sử dụng làm thức ăn bổ sung cho động vật thủy sản hoặc để sản xuất carotenoid với số lượng lớn..
- Thraustochytrid thuộc lớp Labirinthula, ngành Heterokonta, giới Chromista, là nhóm vi tảo biển dị dưỡng đơn bào.
- Tế bào của chúng thường có hình ovan hoặc hình cầu.
- Thraustochytrid gần đây được chú ý đến nhiều do chúng có khả năng sản xuất ra nhiều hợp chất sinh học rất quý trong đó có acid béo không bão hòa omega-3 polyunsatuarated fatty acids (PUFAs) bao gồm docosahexaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA), cả hai hợp chất này rất quan trọng cho sức khỏe con người cũng như trong ngành nuôi trồng thủy sản (Jain et al., 2007.
- Fan et al.
- 2007, Raghukumar, 2008) và gần đây nhiều nghiên cứu đã phát hiện các loài thuộc nhóm vi tảo này có thể sản xuất carotenoid như -caroten, Phoenicoxanthin, astaxanthin và canthaxanthin (Yamaoka et al., 2004, Yokoyama and Honda, 2007), cũng chính vì vậy mà nhóm Thraustochyid đang được ứng dụng rộng rãi như nguồn thức ăn bổ sung cho tôm, cá (Yamasaki et al., 2007)..
- Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh các carotenoid với vai trò là chất chống oxy hóa đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng cách ngăn ngừa các bệnh như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể và một số bệnh khác.
- Do đó, carotenoid đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm (Olson, 1999).
- hội cho sự phát triển của vi tảo bởi vì chúng là một trong những nguồn có khả năng sản xuất carotenoid.
- Hiện nay, nguồn vi tảo sản xuất carotenoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên, việc sử dụng vi tảo có nhiều ưu thế như chúng phát triển đơn giản, vòng đời ngắn, năng suất cao (Chisti, 2007), điều quan trọng nữa là dễ nuôi cấy ở quy mô lớn, tăng trưởng nhanh và sử dụng cơ chất rẻ tiền (Bhosale, 2004).
- Trong những năm gần đây, việc sử dụng các loài vi tảo biển dị dưỡng Thraustochytrid để sản xuất acid béo không no và carotenoid đang ngày càng được quan tâm vì các loài tảo này dễ nuôi cấy và không yêu cầu các yếu tố cần thiết trong nuôi cấy như điều kiện ánh sáng, nguồn CO 2 (Ratledge, 1993).
- Ở Việt Nam, những nghiên cứu về vi tảo biển dị dưỡng và ứng dụng của nó còn khá hạn chế.
- Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và nhận diện dòng vi tảo dị dưỡng Thraustochytrid có khả năng sản xuất carotenoid ở vùng biển tỉnh Cà Mau..
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu.
- 2.2.2 Phân lập vi tảo.
- sau đó bổ sung 300mg/L streptomycin (Strep.) và 300 mg/L penicillin G (Peni.) (Arafiles et al..
- Sau khi phân lập, các dòng vi tảo được lưu trữ trong tủ lạnh 4-6 o C và cấy chuyển trên môi trường GYPS mới mỗi tháng/1 lần..
- 2.2.3 Xác định trọng lượng khô tế bào vi tảo Trọng lượng khô tế bào (TLKTB) vi tảo được xác định như sau: Thu hoạch tế bào trong 200 ml dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm dung dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C.
- 2.2.4 Xác định tốc độ tăng trưởng của tế bào Sự tăng trưởng của tế bào trong dung dịch nuôi cấy được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) tại bước sóng λ= 600 nm trong một dãy OD từ 0,2-1,8 cùng lúc với xác định TLKTB (Taha et al., 2013), thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Từ những thông số thu được xây dựng đường chuẩn qua phương trình hồi quy tuyến tính giữa chỉ số OD và TLKTB của vi tảo có dạng y = ax + b.
- Trong đó, y là chỉ số OD và x là TLKTB tương ứng của vi tảo (g/200ml)..
- 2.2.5 Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập được.
- Nuôi giống cấp II: Sau nhân giống cấp I, mật độ vi tảo được chỉnh về OD 600nm =0,5, chuyển 1 ml dịch vi tảo sang bình tam giác 500 ml chứa 199 ml môi trường GYPS+Strep.+ Peni..
- 2.2.6 Xác định hàm lượng carotenoid.
- Hàm lượng carotenoid được xác định theo phương pháp của Hoàng Thị Lan Anh et al...
- Hàm lượng carotenoid trong dung dịch được tính theo công thức (Strickland and Parsons, 1972):.
- Chuyển 2 ml dung dịch vi tảo vào tuýp eppendorf mới.
- 2.2.8 Phân tích PCR và xác định trình tự DNA Hai đoạn mồi Thrau For.
- Hàm lượng sắc tố (µg/L.
- Sau khi kiểm tra, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch của Promega (Mỹ) và được giải trình tự cả hai đầu 5’ và 3’ bằng máy giải trình tự DNA tự động ABI 3130 (Mỹ).
- Các kết quả giải trình tự gen 18S rRNA được so sánh với các trình tự nucleotid đã được công bố từ dữ liệu trong ngân hàng gen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) bằng cách tìm kiếm các trình tự nucleotid đồng hình qua sử dụng chương trình nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
- Sử dụng các trình tự đã.
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi tảo.
- Dòng vi tảo BCM05 đã được phân lập từ các mẫu lá bần thu tại tỉnh Cà Mau, dòng vi tảo này phát triển tốt trên môi trường thạch GYPS, thời gian khuẩn lạc xuất hiện từ 2 đến 3 ngày.
- Khuẩn lạc có bề mặt trơn nhẵn, mép viền, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng ngà, sau 1-2 tuần khuẩn lạc chuyển sang vàng cam, điều này là do sự tích lũy carotenoid nội bào của vi tảo.
- Đây là đặc điểm đặc trưng của khuẩn lạc của nhiều dòng vi tảo dị dưỡng thuộc nhóm Thraustochytrid đã được phân lập trong những nghiên cứu trước đó (Aki et al., 2003.
- Chatdumrong et al., 2007.
- Hoàng Thị Lan Anh et al., 2010.
- Arafiles et al., 2011).
- Dưới kính hiển vi các tế bào vi tảo dòng BCM05 có dạng hình cầu, đường kính khoảng 20 µm, các tế bào luôn luôn hình thành cụm trong môi trường nuôi cấy (Hình 1)..
- Hình 1: (A) Khuẩn lạc màu hồng của dòng BCM05.
- (B) Hình dạng tế bào dòng BCM05 dưới kính hiển vi với vật kính 100.
- 3.2 Xây dựng đường chuẩn giữa trọng lượng khô và đo mật độ quang (OD) tế bào vi tảo.
- Kết quả xây dựng đường chuẩn về mối tương quan giữa trọng lượng khô và mật độ quang.
- (OD 600nm ) tế bào vi tảo dòng BCM05 đã được chỉ ra trên Hình 2, các điểm hầu như đều nằm trên một đường thẳng, với hệ số tương quan R 2 = 0.9976.
- Trọng lượng khô (g/200ml).
- Hình 2: Đường chuẩn giữa trọng lượng khô và mật độ quang tế bào dòng BCM05 Theo nghiên cứu của Rocha et al.
- xác định nhanh sinh khối khô đã xây dựng đường chuẩn giữa TLKT dòng vi tảo Nannochloropsis sp..
- và đồng thời đo mật độ quang tế bào ở bước sóng 540 nm.
- Trong một báo cáo khác để xác định sự tăng trưởng của vi tảo Schizochytrium sp., và Aurantiochytrium sp., bước sóng được đo tại OD=.
- 600 nm (Hong et al., 2013.
- Taha et al., 2013)..
- Xác định TLKTB của tế bào là một trong những phương pháp thường được sử dụng để định lượng mật số tế bào.
- Ở vi tảo biển việc xác định TLKTB có một vài điểm hạn chế do sự hấp phụ muối trên bề mặt tế bào và các bước rửa muối trước khi sấy khô làm mất đi một lượng tế bào.
- Do đó, việc xây dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và TLKTB vi tảo có ý nghĩa rất lớn, nó giúp xác định nhanh chóng sinh khối khô tảo thông qua việc đo mật độ quang dịch tảo ở bước sóng 600 nm mà không cần phải ly tâm thu sinh khối, sấy khô và cân khối lượng sau khi sấy - một quá trình mất nhiều thời gian và tính chính xác chưa cao do một lượng tế bào có thể bị mất đi sau khi ly tâm..
- 3.3 Hàm lượng carotenoid của dòng vi tảo BCM05.
- Sau 4 ngày nhân sinh khối với thể tích 200 ml, tiến hành trích carotenoid từ sinh khối tươi của dòng vi tảo đã phân lập bằng phương pháp nghiền và lọc như mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu.
- Phân tích kết quả cho thấy dòng BCM05 có hàm lượng carotenoid tổng số là 7.600 µg/kg trọng lượng sinh khối khô..
- TN22 đã được Hoàng Thị Lan Anh et al.
- (2010) phân lập từ đầm ngập mặn Thị Nại - Bình Định chứa hàm lượng carotenoid là 5.200 µ g/kg trọng lượng sinh khối khô và là đối tượng tiềm năng trong ứng dụng nuôi trồng thủy sản, thì dòng vi tảo BCM05 đã được phân lập trong nghiên cứu này chứa hàm lượng carotenoid cao hơn 46%..
- Mặc dù, các vi tảo quang dưỡng được ứng dụng sản xuất carotenoid phổ biến hiện nay như Dunaliella hay Haematococcus có hàm lượng carotenoid rất cao, chẳng hạn tảo Dunaliella salina được nuôi cấy trong 15 ngày trên môi trường chứa 16% NaCl và 2,5 mM nitơ (pH 8,5), thêm 1,5%.
- thể tích CO 2 trong không khí và được chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang cường độ 200 W.m -2 và đèn UV-B 0,50 W.m -2 có thể sản xuất ra carotenoid tổng số với hàm lượng cao nhất là 115 mg/g trọng lượng khô (trong đó β-carotene chiếm 54.
- và Haematococcus pluvialis đạt được hàm lượng astaxanthin cao nhất là 24,5 mg/g trọng lượng khô khi nuôi cấy trên môi trường Basal dưới cường độ ánh sáng 30 µmol.m -2 .s -1 với chu kỳ sáng/tối là 16/8 h và sau đó sinh khối tiếp tục được nuôi trên môi trường Basal có thêm 17,1 mM NaCl và 4,4 mM sodium acetate NaOAC và ủ liên tục dưới cường độ ánh sáng 60 µmol.m -2 .s -1 trong 9 ngày (El-Baky et al., 2004.
- Vidhyavathi et al., 2008).
- Có thể thấy mặc dù hàm lượng sắc tố carotenoid ở loài vi tảo quang dưỡng rất cao nhưng điều kiện nuôi cấy của chúng rất phức tạp và tốn kém hơn rất nhiều so với các dòng dị dưỡng, hơn nữa sự tăng.
- trưởng của các dòng vi tảo quang dưỡng chậm hơn so với các dòng tảo dị dưỡng (Aki et al., 2003)..
- Từ những lý do đó, nếu các dòng vi tảo dị dưỡng được cải thiện quy trình nuôi cấy tăng sinh khối hơn nữa thì việc sử dụng các đối tượng này trong sản xuất carotenoid là rất khả thi..
- 3.4 Xác định trình tự DNA của dòng vi tảo BCM05.
- hình dạng tế bào và sản phẩm PCR bước đầu có thể kết luận dòng vi tảo BCM05 thuộc nhóm Thraustochytrid.
- Tuy nhiên, để có thể kết luận chính xác hơn, sản phẩm PCR đã được tiếp tục xác định trình tự.
- Một đoạn 500bp đã đọc được qua máy giải trình tự, so sánh trình tự này với các trình tự từ ngân hàng dữ liệu trên NCBI bằng chương trình BLAST, kết quả cho thấy sự giống nhau về trình tự 18S rRNA của dòng BCM05 với dòng Aurantiochytrium sp.
- Hình 3: Cây phả hệ của dòng vi tảo BCM05 với các loài vi tảo nhóm Thraustochytrid Phân tích cây phả hệ của dòng BCM05 với các.
- dòng vi tảo khác thuộc nhóm Thraustochytrid (Hình 3) đã cho thấy dòng vi tảo BCM05 có thể thuộc dòng Aurantiochytrium sp..
- Theo báo cáo của Yokoyama và Honda (2007), hầu hết các loài Aurantiochytrium đều có khả năng sản xuất carotenoid và đặc biệt là thành phần carotenoid rất đa dạng bao gồm: -caroten, Phoenicoxanthin, astaxanthin, Echinenone và canthaxanthin.
- Nghiên cứu của Gao et al., (2013) cho thấy Aurantiochytrium sp.
- có hàm lượng lipid chiếm 56,3% trọng lượng khô tế bào, trong đó.
- Do đó, bên cạnh khả năng sản xuất carotenoid, đây cũng là đối tượng lý tưởng để sản xuất dầu sinh học diesel và DHA..
- Dòng vi tảo BCM05 thuộc nhóm Thraustochytrid từ lá bần ở rừng ngập mặn tỉnh Cà Mau đã được phân lập.
- Đường chuẩn giữa OD và TLKTB của vi tảo dòng BCM05 đã được xây dựng với hệ số tương quan cao nên có thể sử dụng trị số OD trong nghiên cứu tảo.
- Hàm lượng carotenoid tổng số của dòng này là 7.600 µg/kg.
- quả giải trình tự đoạn gen 18S-rRNA của dòng BCM05 và qua việc xây dựng cây phả hệ đã cho thấy dòng vi tảo này thuộc chi Aurantiochytrium và được đặt tên là Aurantiochytrium sp.
- Tập thể các tác giả xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Cần Thơ đã cấp kinh phí cho công trình nghiên cứu này.
- Các thí nghiệm được tiến hành có sử dụng trang thiết bị của phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ..
- Phân lập một số dòng vi tảo biển dị dưỡng nhóm.
- Thraustochytrid sản xuất carotenoid ở tỉnh Cà Mau.
- Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ..
- microalga, Aurantiochytrium sp.
- Phân lập chủng vi tảo biển dị dưỡng mới thuộc chi Thraustochytrium giàu DHA và carotenoid từ đầm ngập mặn Thị Nại - Bình Định.
- Kanada and H.Okuyama