Phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây hoa vạn thọ (Tagetes papula L.) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith

- PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO XANH TRÊN CÂY HOA VẠN THỌ (Tagetes papula L.) DO VI KHUẨN Ralstonia solanacearum SMITH.
- solanacearum, thực khuẩn thể.
- Phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể(TKT) có hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây vạn thọ được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lướinhằm tìm ra dòng TKT có triển vọng trong quản lý bệnh héo vi khuẩn trên cây hoa vạn thọ.
- Kết quả phân lập được 38 dòng thực khuẩn thể và 21 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ các mẫu cây bệnh và đất được thu thập tại các tỉnhCần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Tiền Giang và Đồng Tháp.
- Các dòng thực khuẩn thể có khả năng ký sinh số lượng vi khuẩn ký chủ R.solanacearum khác nhau, ghi nhận 10 dòng thực khuẩn thể có khả năng ký sinh nhiều dòng vi khuẩn nhất (từ 15-16 chủng).
- Trong đó, ba dòng thực khuẩn thể ΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4 có khả năng phân giải vi khuẩn ký chủ mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 6,09 mm, 5,88 mm và 7,99 mm ở thời điểm 72 giờ sau khi cấy.
- Trong điều kiện nhà lưới, áp dụng các dòng thực khuẩn thể ΦCT18, ΦĐT3, ΦĐT4 đơn lẻ và hỗn hợp 3 dòng thực khuẩn thể ở mật số 10 8 PFU/ml tưới vào đất trong phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn R.
- Phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây hoa vạn thọ (Tagetes papula L.) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith.
- Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith là một trong những loại bệnh.
- Vi khuẩn có nguồn gốc trong đất, gây hại trên 200 loài cây trồng thuộc trên 50 họ thực vật khác nhau (Yamada, 2012).
- Theo Nguyễn Thị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy (2014), bệnh héo xanh do vi khuẩn R.
- Vi khuẩn R.
- Mặt khác, nhiều vi khuẩn gây hại cây trồng xuất hiện tính kháng thuốc gốc đồng và kháng sinh đang là vấn đề đáng quan tâm hiện nay (Ronald, 2011).Ứng dụng thực khuẩn thể (TKT) trong phòng trị bệnh do vi khuẩn cũng là một phần của chiến lược quản lý bệnh tổng hợp trên cây trồng (Balogh et al., 2010, Addy et al., 2012).
- Nguyễn Thị Trúc Giang và ctv., 2014), bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas sp.
- Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về TKT đối với vi khuẩn R..
- “Phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh héo xanh trên câyhoa vạn thọ (Tagetes papula L.) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith” được thực hiện nhằm chọn được dòng TKT có khả năng kí sinh rộng và phân giải vi khuẩn R..
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập các dòng TKT phân bố ở một số tỉnh ĐBSCL đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
- Phân lập vi khuẩn R.
- solanacearum gây bệnh: Quan sát dòng vi khuẩn tuôn ra từ mẫu bệnh được cắt nhỏ dưới kính hiển vi, dùng micropipet nhỏ một giọt dung dịch trên đĩa petri chứa môi trường King’s B agar, dùng que cấy vi khuẩn theo hình zic-zắc để tạo đơn khuẩn lạc.
- Ủ đĩa vi khuẩn trong 48 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm.
- Rút 50 µL dung dịch chứa TKT cộng với 100 µL huyền phù vi khuẩn R..
- Dùng tăm bông thanh trùng cấy truyền từng vòng vô khuẩn sang đĩa petri mới có hòa sẵn vi khuẩn ký chủ, sau 24 giờ tiến hành thu TKT bằng cách thêm vào đĩa 5 mL nước cất thanh trùng cộng với 20 µL chloroform lắc đều và để trong 5 phút, tiếp tục ly tâm với vận tốc 6000 vòng/phút trong 5 phút.
- Chỉ tiêu ghi nhận: Sự phân giải của các dòng TKT trên các chủng R.
- Xử lý số liệu bằng cách đếm tổng số vi khuẩn bị kí sinh bởi mỗi dòng TKT, và tổng số TKT kí sinh trên mỗi dòng vi khuẩn từ đó xác định đượcphổ kí chủ của TKT cũng như dòng vi khuẩn mẫn cảm bị ký sinh bởi nhiều dòng TKT nhất..
- 2.3 Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn R..
- solanacearum của các dòng TKT trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, hai nhân tố (nhân tố A là 3 chủng vi khuẩn bị ký sinh nhiều nhất, nhân tố B là 10 dòng TKT có phổ kí chủ rộng nhất được chọn từ thí nghiệm 2.3) và 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri..
- Chuẩn bị nguồn TKT: Nhân mật số các dòng TKT được chọn trong 24 giờ, thực hiện đếm mật số và pha loãng để tạo huyền phù các dòng TKT khác nhau ở mật số 10 3 PFU/mL..
- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Nuôi cấy các dòng vi khuẩn R.
- solanacearum được chọn từ thí nghiệm 2.2 trên đĩa petri chứa môi trường King’s B trong 48 giờ cho khuẩn lạc phát triển, pha loãng để tạo huyền phù vi khuẩn có giá trị OD 600nm = 0,3..
- Tiến hành: Rút 50 µL huyền phù từng dòng TKT (10 3 PFU/mL.
- 100 µL huyền phù vi khuẩn R.
- 2.4 Đánh giá khả năng phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn R.
- Chuẩn bị vi khuẩn:Chủng vi khuẩn RsCT7 là chủng vi khuẩn mẫn cảm nhất được chọn từ thí nghiệm 2.3 được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường King’s B trong 48 giờ cho khuẩn lạc phát triển, cho nước cất thanh trùng vào đĩa và thu huyền phù vi khuẩn, thực hiện pha loãng để đạt huyền phù có giá trị OD 600nm = 0,3..
- Phương pháp xử lý TKT: Cây con sau khi trồng được 20 ngày, tướihuyền phù từng dòng TKT tương ứng với từng nghiệm thức xung quanh gốc cây (5 ml/cây) vào buổi chiều sau khi tắt nắng..
- tưới huyền phù vi khuẩn (OD 600nm = 0,3) đã được chuẩn bị vào đất xung quanh gốc cây (5 ml vi khuẩn/cây)..
- Mục đích nhằm khảo sát khả năng tồn tại của các dòng TKT trong môi trường..
- Rút lấy phần dung dịch trong cho vào ống falcon cùng 20 µl chloroform/mL dung dịch, lắc đều và để trong 5 phút, ly tâm với vận tốc 6000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ vi khuẩn.
- Sau đó rút ra 100 µL của mỗi nồng độ pha loãng cộng với 100 µL huyền phù vi khuẩn (OD 600nm = 0,3) vào đĩa Petri cùng với 10 ml môi trường King B agar 0,8 % ở 50 o C, hòa đều.
- Kết quả phân lập được 21 chủng vi khuẩn R..
- solanacearum và 38 dòng TKT có khả năng ký.
- sinh vi khuẩn ký chủ từ các mẫu cây hoa vạn thọ bệnh và mẫu đất thu thập ở các tỉnh thành Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Tiền Giang và Đồng Tháp (Bảng 1).
- Tương tự, Kalpage và Costa (2015) đã phân lập được 6 dòng TKT ký sinh 19 chủng vi khuẩn R.solanacearum phân lập từ cây cà chua bị bệnh héo xanh, Addy et al.
- (2016) đã phân lập được 2 dòng TKT ΦRSSKD1 và ΦRSSKD2 từ đất trồng chuối bị nhiễm bệnh có khả năng ký sinh 9 dòng vi khuẩn R.
- solanacearum phân lập từ thân cây chuối bị héo do vi khuẩn.
- Mẫu bệnh có hiện diện vi khuẩn.
- Mẫu bệnh có hiện diện vi khuẩn 1 ΦCT1 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 20 ΦAG5 Tri Tôn - An Giang - 2 ΦCT7a Bình Thủy - TP Cần Thơ + 21 ΦĐT1a TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 3 ΦCT7b Bình Thủy - TP Cần Thơ + 22 ΦĐT1b TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 4 ΦCT12 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 23 ΦĐT2 TP Sa Đéc - Đồng Tháp - 5 ΦCT13 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 24 ΦĐT3 TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 6 ΦCT14 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 25 ΦĐT4 TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 7 ΦCT15 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 26 ΦĐT5a TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 8 ΦCT16 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 27 ΦĐT5b TP Sa Đéc - Đồng Tháp + 9 ΦCT17a Bình Thủy - TP Cần Thơ + 28 ΦHG1 Long Mỹ - Hậu Giang + 10 ΦCT17b Bình Thủy - TP Cần Thơ + 29 ΦHG2 Long Mỹ - Hậu Giang - 11 ΦCT18 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 30 ΦHG3a Long Mỹ - Hậu Giang + 12 ΦCT19 Bình Thủy - TP Cần Thơ + 31 ΦHG3b Long Mỹ - Hậu Giang + 13 ΦCT20 Bình Thủy - TP Cần Thơ - 32 ΦHG4 Long Mỹ - Hậu Giang - 14 ΦAG1 Tri Tôn - An Giang - 33 ΦHG5 Long Mỹ - Hậu Giang - 15 ΦAG2a Tri Tôn - An Giang + 34 ΦHG6a Long Mỹ - Hậu Giang - 16 ΦAG2b Tri Tôn - An Giang + 35 ΦHG6b Long Mỹ - Hậu Giang - 17 ΦAG3 Tri Tôn - An Giang + 36 ΦHG7 Long Mỹ - Hậu Giang - 18 ΦAG4a Tri Tôn - An Giang + 37 ΦTG1 TP Mỹ Tho - Tiền Giang + 19 ΦAG4b Tri Tôn - An Giang + 38 ΦTG2 TP Mỹ Tho - Tiền Giang + Chú thích.
- 3.2 Kết quả đánh giá khả năng ký sinh của các dòng TKT đối với các chủng vi khuẩnR..
- solanacearum phân lập tại một số tỉnh ĐBSCL Kết quả ghi nhận khả năng ký sinh của các dòng TKT trên các chủng vi khuẩn R..
- solanacearum là khác nhau biến động trong khoảng 11-16 chủng trong tổng số 21 chủng vi khuẩn được kiểm tra.
- Các dòng TKTΦCT12, ΦCT13, ΦCT14, ΦCT18, ΦCT19, ΦCT20, ΦAG4a, ΦĐT3, ΦĐT4 vàΦHG4 có khả năng ký sinh nhiều chủng vi khuẩn nhất (từ 15-16 chủng)..
- chủng vi khuẩn), các dòng TKT còn lại ký sinh từ 12 đến 14 chủng vi khuẩn (Bảng 2)..
- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có phổ ký chủ rộng, đa dạng kiểu gen và kiểu hình giữa các chủng (Hayward, 2000, trích dẫn bởiKalpage và Costa, 2015).
- Vì vậy, xác định phổ ký chủ rộng của mỗi dòng TKT được phân lập là điều cần thiết trước khi quyết định chọn số lượng TKT sử dụng như tác nhân sinh học phòng trừ bệnh héo do vi khuẩn.
- Từ kết quả Bảng2 và Bảng 3, chọn 10 dòng TKT ΦCT12, ΦCT13, ΦCT14, ΦCT18, ΦCT19, ΦCT20, ΦAG4a, ΦĐT3, ΦĐT4 và ΦHG4 có khả năng ký sinh nhiều chủng vi khuẩn ký chủ nhất và.
- 03 chủng vi khuẩn RsCT, RsAG2, RsĐT3 là chủng.
- vi khuẩn mẫn cảm nhất bị các dòng TKT khác nhau ký sinh nhiều nhấtđể thực hiện các thí nghiệm tiếp theo..
- Bảng 2: Khả năng ký sinh của 38 dòng TKT trên 21 chủng vi khuẩn R.
- Mã số TKT SL vi khuẩn bị.
- ký sinh Mã số TKT SL vi khuẩn bị.
- Trung bình khả năng ký sinh của các dòng TKT 13,8.
- Bảng 3: Số lượng TKT ký sinh trên các chủng vi khuẩn R.solanacearum được phân lập Mã số vi.
- Mã số vi khuẩn.
- ký sinh Mã số vi khuẩn SL TKT ký sinh.
- Trung bình số lượng TKT ký sinh trên một chủng vi khuẩn 25 3.3 Kết quả đánh giá khả năng phân giải vi.
- solanacearum của các dòng TKT có khả năng ký sinh rộng trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Kích thước vòng vô khuẩn càng lớn chứng tỏ dòng TKT có khả năng phân giải vi khuẩn ký chủ càng mạnh..
- Ở thời điểm 24 giờ sau khi cấy (GSKC), tất cả các TKT đều thể hiện khả năng phân giải trên các vi khuẩn ký chủ, đường kính phân giải trung bình của các TKT từ mm.
- Dòng TKTΦĐT4 có đường kính phân giải lớn nhất (2,97 mm), khác biệt thống kê so với các dòng TKT khác nhưng không khác biệt với dòng ΦCT18 (2,69 mm).
- Quá trình phân giải vi khuẩn của các TKT diễn ra mạnh mẽ nhất ở thời điểm 48 GSKC với đường kính vòng vô khuẩn đều tăng rất nhanh so với thời điểm 24 GSKC.
- Dòng TKTΦĐT4 có đường kính phân giải trung bình lớn nhất (6,38 mm), tăng gấp đôi so với thời điểm 24 GSKC, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng TKT khác.
- Điều này có thể do tốc độ nhân mật số của vi khuẩn đã chậm lại và chuyển sang giai đoạn suy vong (death phase) (Lương Hữu Tâm, 2013).
- Các dòngTKT ΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4 có đường kính phân giải trung bình lớn nhất (lần lượt là 6,09 mm, 5,88 mm và 7,99 mm), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng TKT khác.
- Chủng vi khuẩn RsCT7 có đường kính phân giải trung bình lớn nhất (5,26 mm), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chủng vi khuẩn RsAG2 và RsĐT3 (Bảng 4)..
- Nhìn chung, các dòng TKT đều có khả năng phân giải tốt trên các chủng vi khuẩn RsCT7, RsAG2 và RsĐT3.
- Dòng TKTΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4 có khả năng phân giải các chủng vi khuẩn RsCT7, RsAG2 và RsDT3 cao hơn so với các dòng TKT còn lại thể hiện qua kích thước vòng vô khuẩn, tính ổn định ở các thời điểm đánh giá..
- Chủng vi khuẩn RsCT7 được xem là chủng vi khuẩn mẫn cảm nhất, được chọn như là vi khuẩn ký chủ để nhân mật số các dòng TKTΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4, đồng thời là nguồn vi khuẩn lây bệnh nhân tạo cho các nghiên cứu tiếp theo..
- Bảng 4: Đường kính phân giải của 10 dòng TKT đối với 3 chủng vi khuẩn R.solanacearum ở thời điểm GSKC trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- 3.4 Hiệu quả phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum của các dòng TKT triển vọng trong điều kiện nhà lưới.
- riêng nghiệm thức áp dụng dòng TKT ΦĐT4 chưa xuất hiện bệnhtuy nhiên chưa có khác biệt thống kê giữa các nghiệm thức.Quan sát ở thời điểm 15 NSKLB, nghiệm thức ΦĐT4 có tỷ lệ bệnh thấp nhất (15%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng, các nghiệm.
- Về chỉ số AUDPC, nghiệm thức xử lý dòng TKT ΦĐT4 đạt thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (Bảng 5).
- Các nghiệm thức áp dụng dòng thực khuẩn thể ΦCT18, ΦĐT3, hỗn hợp 3 dòng TKT và sử dụng thuốc Starner không thể hiện hiệu quả phòng trừ qua các thời điểm..
- Bảng 5: Tỷ lệ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearumtrong điều kiện nhà lưới qua các thời điểm khảo sát.
- Dòng TKT ΦĐT4 có mật số cao nhất, khác biệt ý nghĩa so với dòng TKT ΦĐT3 và hỗn hợp TKT.
- Mật số các dòng thực khuẩn thể bắt.
- Hình 1: Mức độ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R.
- Xử lý hỗn hợp 3 dòng TKT (ΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4);.
- Tóm lại, áp dụng dòng TKT ΦĐT4 trong phòng trị bệnh héo xanh trên cây vạn thọ do vi khuẩn R.solanacearum cho hiệu quả giảm bệnh hơn các nghiệm thức còn lại (Hình 1).
- Các TKT xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn ký chủ có thể phát triển và tiếp tục sản xuất các thể phage mới trong điều kiện thích hợp, có thể được xem như là một công cụ trong kiểm soát bệnh héo trên cây trồng bằng cách làm giảm tính độc của vi khuẩn (Addy et al., 2012).
- Do đó, để áp dụng thực khuẩn thể một cách hiệu quả, điều quan trọng là các thực khuẩn thể phải tiếp xúc với vi khuẩn ký chủ (Goodride, 2004, trích dẫn bởi Jones et al., 2007), nồng độ thực khuẩn thể ban đầu đủ cao (Gill và Abedon, 2003).
- Vì vậy, sử dụng thực khuẩn thể có khả năng tồn tại lâu, nhân mật số với sự hiện diện của vi khuẩn ký chủ sẽ có hiệu quả kiểm soát mầm bệnh tốt hơn..
- Kết quả phân lập được 38 dòng TKT có khả năng ký sinh 21 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum khác nhau tại các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Tiền Giang, Đồng Tháp và thành phố Cần Thơ.
- Ghi nhận 10 dòng TKT có khả năng ký sinh rộng trên các chủng vi khuẩn phân lập, gồm:ΦCT12, ΦCT13, ΦCT14, ΦCT18, ΦCT19, ΦCT20, ΦAG4a, ΦĐT3, ΦĐT4, và ΦHG4.
- Trong đó, 3 dòng ΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4 có khả năng phân giải vi khuẩn R.solanacearum cao nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm..
- Nghiệm thức xử lý dòng thực khuẩn thể ΦĐT4 phân lập tại tỉnh Đồng Tháp thể hiện hiệu quả giảm bệnh héo xanh trên cây vạn thọ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum cao hơn dòng ΦCT18 và ΦĐT3 đến thời điểm 17 NSKLB trong điều kiện nhà lưới và duy trì mật số ổn định hơn so với các nghiệm thức còn lại..
- Phân lập và bước đầu đánh giá khả năng hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthononas oryzae của một số chủng thực khuẩn thể ở ĐBSCL.
- Phân lập thực khuẩn thể và đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
- Khảo sát phương pháp phân lập thực khuẩn thể và hiệu quả phòng trị của thực khuẩn thể đối với bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
- Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại cây khoai tây vùng Hà Nội–phụ cận và biện pháp phòng trừ..
- Phân lập và đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc phòng trừ bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas sp