- DOI:10.22144/ctu.jvn.2018.177 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM HÒA TAN LÂN. - Aspergillus tubingensis, đất lúa, lân hòa tan, nấm hòa tan lân, Penicillium funiculosum, phân lập. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân lập và định danh một số dòng nấm hòa tan lân cao từ nền đất lúa tưới nước ngập khô xen kẽ kết hợp bón phân hữu cơ ở nhà lưới. - Môi trường NBRIP dùng để phân lập và đánh giá khả năng hòa tan lân. - Lân hòa tan được xác định bằng phương pháp hiện màu molybdate.. - Kết quả cho thấy tổng cộng có 37 dòng nấm có khả năng hòa tan lân được phân lập từ 7 mẫu đất. - Hai dòng nấm này đều hòa tan lân tốt ở mức pH từ 5-7, nhiệt độ 25 o C-35 o C, độ mặn lên đến 0,5-1% NaCl và hòa tan tốt các dạng lân khó tan như AlPO 4 và FePO 4 . - Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm hòa tan lân từ nền đất trồng lúa khô ngập xen kẽ kết hợp bón phân hữu cơ. - Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium và Enterobacter có khả năng hòa tan lân mạnh nhất và hiệu quả nhất (Whitelaw et al., 2000. - Công bố của Nguyễn Hữu Hiệp và Hà Danh Đức (2009) cho thấy tổng cộng có 34 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân được phân lập từ đất trồng đậu phộng tại Trà Vinh. - (2011), các dòng vi khuẩn Citrobacter sp., Shigella sp., và Bacillus circulans có khả năng hòa tan lân rất hiệu quả được phân lập từ vùng rễ cây cỏ khu vực gần biển. - Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập và định danh một số dòng nấm có khả năng hòa tan lân từ nền đất trồng lúa áp dụng biện pháp tưới nước ngập khô xen kẽ kết hợp với bón phân hữu cơ.. - 2.2 Phân lập các dòng nấm có khả năng hòa tan lân trên môi trường chuyên biệt NBRIP. - 2.3 Đánh giá khả năng hòa tan lân của các dòng nấm phân lập trong môi trường NBRIP. - Hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng được thu thập theo các ngày và 11 ngày sau khi nuôi cấy. - Hàm lượng lân hòa tan bởi nấm trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp hiện màu Molybdate. - 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy lên khả năng hòa tan lân của dòng nấm B1 và B10 hòa tan lân tốt nhất. - Dòng nấm B1 và B10 cho kết quả hòa tan lân tốt nhất trong tổng số 37 dòng nấm phân lập. - Khả năng hòa tan lân của dòng nấm B1 và B10 lần lượt là 2104 mg.L -1 P 2 O 5 và 2618 mg.L -1 P 2 O 5 sau 3 và 4 ngày bố trí thí nghiệm trong môi trường NBRIP lỏng.. - Hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy được xác định sau ngày bố trí thí nghiệm. - Phân tích lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng bằng phương pháp hiện màu Molybdate (như trong mục 2.3.2).. - 2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl Toàn bộ qui trình và cách bố trí thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của pH lên khả năng hòa tan lân của 2 dòng nấm B1 và B10 ở mục 2.4.2. - Hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy được xác định sau 1, 3, 5 và 7 ngày bố trí thí nghiệm.. - Toàn bộ qui trình và cách bố trí thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của pH lên khả năng hòa tan lân của 2 dòng nấm B1 và B10 ở mục 2.4.2. - Hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy được xác định sau 1, 3, 5 và 7 ngày bố trí thí nghiệm. - 2.4.5 Đánh giá khả năng hòa tan hai dạng lân khó tan khác (FePO 4 và AlPO 4. - 2.5 Định danh 2 dòng nấm B1 và B10 có khả năng hòa tan lân cao nhất bằng phương pháp giải trình tự đoạn ITS. - DNA của 2 dòng nấm B1 và B10 cho khả năng hòa tan lân cao nhất được được tách chiết bằng cách sử dụng CTAB 3% theo phương pháp của Ihrmark et al. - 3.1 Kết quả phân lập các dòng nấm có khả năng hòa tan lân từ nền đất trồng lúa áp dụng biện pháp tưới nước ngập khô xen kẽ kết hợp bón phân hữu cơ. - Bảng 1: Các dòng nấm hòa tan lân được phân lập từ 7 mẫu đất lúa. - dòng nấm. - Tổng số dòng nấm . - 3.2 Khả năng hòa tan lân của 37 dòng nấm phân lập. - Kết quả đánh giá về khả năng hòa tan lân của 37 dòng nấm phân lập trong môi trường NBRIP lỏng sau 8 ngày nuôi cấy cho thấy các dòng nấm phân lập có khả năng hòa tan lân dao động từ 1300 mg.L -1 đến 2200 mg.L -1 . - Trong đó, 8 dòng nấm ký hiệu S1.2, S3.1, S3.3, S5.4, S6.7, S7.1, B1 và B10 thể hiện khả năng hòa tan lân cao nhất sau 3 và 4 ngày nuôi cấy và dao động từ 1100 mg.L -1 đến 2600 mg.L -1 (Hình 1). - Khả năng hòa tan lân của 8 dòng nấm tuyển chọn khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% (p<0,05) khi so sánh với nhau. - Tám dòng nấm thử nghiệm thể hiện khả năng hòa tan lân nhanh và cao nhất trong giai đoạn 0-4 ngày nuôi cấy, đạt ngưỡng cao nhất ở thời điểm 3-4 ngày nuôi cấy và sau đó giảm dần theo thời gian thí nghiệm. - Dòng nấm ký hiệu B10 là dòng hòa tan lân cao nhất trong tổng số 8 dòng nấm tuyển chọn, khả năng hòa tan lân cao nhất đạt 2618 mg.L -1 sau 4 ngày thí nghiệm,. - kế đến là dòng nấm phân lập B1 có khả năng hòa tan lân cao nhất đạt 2104 mg.L -1 sau 3 ngày nuôi cấy.. - Trong khi 6 dòng nấm còn lại hòa tan lân cao nhất vào thời điểm 3 ngày nuôi cấy và giao động trong khoảng từ 1100 mg.L -1 đến 2100 mg.L -1 . - Kết quả hòa tan lân Ca 3 (PO 4 ) 2 của 2 dòng nấm B1 và B10 cao hơn so với một số dòng nấm phân lập từ các kết quả nghiên cứu trước đây.. - Điển hình như nghiên cứu của Ruangsanka (2014) cho thấy dòng nấm Penicilium oxalicum phân lập từ vùng rễ cây măng tây có khả năng hòa tan được 556 mg.L -1 P 2 O 5 từ dạng lân Ca 3 (PO 4 ) 2 khó tan trong môi trường NBRIP sau 4 ngày thí nghiệm. - Tuy nhiên, khả năng hòa tan lân của hai dòng nấm B1 và B10 lại tương đương với kết quả. - ký hiệu M33 và M72 có khả năng hòa tan lân tốt nhất lần lượt đạt 2,07 mg/mL và 2,61 mg/mL sau 5 và 7 ngày thí nghiệm.. - Hình 1: Diễn biến hàm lượng lân hòa tan trong môi trường NBRIP lỏng bởi 8 dòng nấm tuyển chọn (n = 3, độ lệch chuẩn). - 3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng hòa tan lân của 2 dòng B1 và B10. - Khả năng hòa tan lân của hai dòng nấm B1 và B10 trong môi trường NBRIP lỏng ở các mức pH khác nhau trong 10 ngày nuôi cấy được trình bày trong Hình 2. - Nhìn chung, hàm lượng lân hòa tan bởi dòng nấm B1 và B10 trong môi trường nuôi cấy có các mức pH khác nhau khác biệt thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau ở từng thời điểm thu mẫu. - Đối với dòng nấm B1, ở tất cả các nghiệm thức có pH khác nhau, hàm lượng lân hòa tan đều tăng nhanh ở giai đoạn 0-3 ngày nuôi cấy, đạt cao nhất ở ngày 3 và sau đó có xu hướng giảm nhẹ theo thời gian thí nghiệm. - Hai nghiệm thức pH 5 và pH 7 có hàm lượng lân hòa tan cao nhất ở tất cả các thời điểm thu mẫu và cao hơn hai nghiệm thức còn lại (pH 3 và pH 9), tuy nhiên, không khác biệt nhau khi so sánh với nhau (p>0,05). - Nghiệm thức pH 3 cho khả năng hòa tan lân thấp nhất ở tất cả các thời điểm thu mẫu. - Vào thời điểm 3 ngày nuôi cấy ở hai nghiệm thức pH 5 và pH 7 dòng nấm B1 hòa tan lân cao nhất lần lượt đạt 1849 mg.L -1 P 2 O 5 và 1836 mg.L -1 P 2 O 5 . - Đối với dòng nấm B10, ở tất cả các nghiệm thức có pH khác nhau, hàm lượng lân hòa tan đều tăng nhanh ở giai đoạn 0-6 ngày nuôi cấy, đạt cao nhất ở ngày 6 và sau đó có xu hướng giảm nhẹ theo thời gian thí nghiệm. - 9 có hàm lượng lân hòa tan cao nhất ở tất cả các thời điểm thu mẫu và cao hơn so với nghiệm thức còn lại (pH 3), tuy nhiên, không khác biệt nhau khi so sánh với nhau (p>0,05). - Nghiệm thức pH 3 cho khả năng hòa tan lân thấp nhất ở tất cả các thời điểm thu mẫu.. - Vào thời điểm 6 ngày nuôi cấy ở ba nghiệm thức pH 5, pH 7 và pH 9 dòng nấm B10 hòa tan lân cao nhất lần lượt đạt 2305 mg.L -1 P 2 O 5 , 2209 mg.L -1 P 2 O 5 và 2229 mg.L -1 P 2 O 5 . - Như vậy, điều kiện pH môi trường tối ưu cho hai dòng nấm hòa tan lân B1 và B10 hòa tan lân tốt nhất ở ngưỡng pH 5-7. - Tác giả Phạm Thị Ngọc Lan và Trần Thị Thanh Nhàn (2008) cho thấy khả năng hòa tan lân cao nhất của hai chủng nấm mốc M8 và M24 phân lập từ đất trồng hoa màu ở tỉnh Thừa Thiên Huế ở môi trường có pH 6. - Như vậy, đa số các chủng nấm hòa tan lân thường sinh trưởng, phát triển và hòa tan lân cao nhất ở môi trường có pH acid nhẹ, trung tính và hơi kiềm.. - Hình 2: Diễn biến hàm lượng lân hòa tan bởi dòng nấm B1 (A) và B10 (B) trong môi trường NBRIP lỏng ở các mức pH khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy (n = 3, độ lệch chuẩn). - 3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ muối NaCl khác nhau lên khả năng hòa tan lân của 2 dòng nấm B1 và B10 trong môi trường NBRIP lỏng trong 9 ngày nuôi cấy được trình bày ở Hình 3.. - Kết quả cho thấy trong dãy nồng độ muối khác nhau từ 0 - 1%, 2 dòng nấm B1 và B10 thể hiện khả năng hòa tan lân khác nhau. - Hàm lượng lân hòa tan tăng liên tục ở các nghiệm thức trong giai đoạn từ 0-7 ngày, đạt cao nhất ở ngày 7 và sau đó giảm mạnh.. - M33 hòa tan lân cao nhất ở nồng độ NaCl nằm trong dãy 5-15‰, trong khi dòng nấm Aspergillus sp.. - M72 hòa tan lân cao nhất ở nồng độ NaCl nằm trong dãy 5-10‰. - Dòng nấm B1. - Dòng nấm B10. - Hình 3: Diễn biến hàm lượng lân hòa tan bởi dòng nấm B1 (A) và B10 (B) trong môi trường NBRIP lỏng ở các nồng độ mặn khác nhau sau 9 ngày nuôi cấy (n = 3, độ lệch chuẩn). - Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mức nhiệt độ thí nghiệm khác nhau lên khả năng hòa tan lân của 2 dòng nấm B1 và B10 trong môi trường NBRIP lỏng trong 11 ngày nuôi cấy được trình bày trong Hình 4. - Nhìn chung, cả hai dòng nấm thử nghiệm có cùng chung xu hướng về kết quả thí nghiệm và diễn biến hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Hàm lượng lân hòa tan ở tất cả các nghiệm có xu hướng tăng nhanh ở giai đoạn 0-7 ngày nuôi cấy, đạt cao nhất ở ngày 7 và sau đó giảm dần theo thời gian thí nghiệm. - Tuy nhiên, hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy bởi 2 dòng nấm B1 và B10 trong thí nghiệm nhiệt độ này thấp hơn rất nhiều so với các thí nghiệm khác là do bình tam giác chứa mẫu không được lắc trên máy lắc mà được để yên ở trong tủ ủ với mức nhiệt độ tương thích. - Hàm lượng lân hòa tan bởi hai dòng nấm B1 và B10 trong môi trường nuôi cấy lỏng ở nghiệm thức nhiệt độ nuôi cấy 45 o C rất thấp ở tất cả thời điểm thu mẫu . - Hàm lượng P 2O5 hòa tan trong môitrườngNBRIP(ppm). - B Dòng nấm B1. - Hình 4: Diễn biến hàm lượng lân hòa tan bởi dòng nấm B1 (A) và B10 (B) trong môi trường NBRIP lỏng ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 11 ngày nuôi cấy (n = 3, độ lệch chuẩn). - 3.3.4 Đánh giá khả năng hòa tan lân từ các dạng lân khó tan FePO 4 và AlPO 4. - Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân bởi hai dòng nấm B1 và B10 trong môi trường NBRIP lỏng với 3 dạng lân khó tan khác nhau gồm: Ca 3 (PO 4 ) 2,. - Kết quả cho thấy ở nghiệm thức môi trường NBRIP chứa lân khó tan dạng Ca 3 (PO 4 ) 2 , hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy của 2 dòng nấm B1 và B10 đạt cao nhất lần lượt là 1716 mg/L P 2 O 5 và 2499,5 mg/L P 2 O 5 sau 5 ngày nuôi cấy và cao hơn rất nhiều so với hai nghiệm thức môi trường NBRIP bổ sung hai dạng lân khó tan FePO 4 và AlPO 4 . - Ở nghiệm thức chứa AlPO 4 , hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy của 2 dòng nấm B1 và B10 đạt cao nhất lần lượt 279,5 mg/L P 2 O 5 và 676,2 mg/L P 2 O 5 sau 10 và 8 ngày nuôi cấy. - 2 dòng nấm B1 và B10 hòa tan cao nhất lần lượt đạt 52,3 mg/L P 2 O 5 và 692 mg/L P 2 O 5 sau 8 và 10 ngày nuôi cấy. - Kết quả này cho thấy khả năng hòa tan lân bởi 2 dòng nấm B1 và B10 với 3 dạng lân khó tan được xếp theo thứ tự như sau: Ca 3 (PO 4 ) 2 >. - Dòng nấm B10 luôn cho khả năng hòa tan lân cao hơn so với dòng B1 khi so sánh với nhau trong cùng 1 nghiệm thức có chứa nguồn lân khó tan giống nhau (Ca 3 (PO 4 ) 2 , AlPO 4 và FePO 4. - Mặc dù, khả năng hòa tan lân dạng AlPO 4 và FePO 4 bởi 2 dòng nấm B1 và B10 thấp hơn nhiều so với dạng Ca 3 (PO 4 ) 2 nhưng kết quả này cho thấy 2 dòng nấm này có khả năng hòa tan được hai dạng lân khó tan trong đất đặc biệt là vùng đất phèn nơi lân bị bất động chủ yếu dưới dạng AlPO 4 và FePO 4 . - Hàm lượng P 2O5 hòa tan trong môi trường NBRIP (ppm). - Hình 5: Diễn biến hàm lượng lân hòa tan bởi dòng nấm B1 (A) và B10 (B) trong môi trường NBRIP lỏng bổ sung các dạng lân khó tan khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy (n = 3, độ lệch chuẩn) 3.4 Định danh 2 dòng nấm hòa tan lân B1. - Như vậy, hai dòng nấm B1 và B10 có chức năng hòa tan lân thuộc chi Penicillium và Aspergillus và được định danh lần lượt như Penicillium funiculosum B1 và Aspergillus tubingensis B10 (Bảng 2). - Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy chi nấm Penicillium sp và Aspergillus có khả năng hòa tan lân rất cao và chúng được sử dụng rộng rãi cho cây trồng (Wakelin et al., 2004). - có khả năng hòa tan lân cao và đồng thời có vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học và phân huỷ chất hữu cơ (Chuang et al., 2007. - Bên cạnh đó, dòng nấm Aspergillus niger hòa tan lân cao lại có chức năng đối kháng với dòng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh đạo ôn lúa và thối nhũn bắp cải lên đến 64%.. - (2012) cho thấy khi bón phân lân kết hợp chủng 2 dòng nấm Penicillium bilaji và Penicillium sp hòa tan lân vào đất giúp tăng năng suất bắp từ 20- 23% so với nghiệm thức đối chứng. - Hai dòng nấm ký hiệu B1 và B10 phân lập từ mẫu đất trồng lúa áp dụng biện pháp tưới nước ngập khô xen kẽ kết hợp bón phân hữu cơ hòa tan lân Ca 3 (PO 4 ) 2 cao trong môi trường NBRIP lỏng, lần lượt đạt 2104 mg.L-1 và 2618 mg.L -1 sau 3 và 4 ngày thí nghiệm. - Các điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu cho hai dòng nấm này hòa tan lân Ca 3 (PO 4 ) 2. - Tuy nhiên, khả năng hòa tan lân AlPO4 của hai dòng nấm B1 và B10 tốt hơn so với lân FePO 4 . - Dòng nấm B10 có khả năng hòa tan lân cao hơn dòng nấm B1 ở tất cả các lân, đặc biệt là dạng lân FePO 4 . - Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy một số chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ và thử nghiệm trồng cây ngập mặn. - Phân lập các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân cho đậu phộng trồng ở Trà Vinh. - hưởng của nhiệt độ đối với vi sinh vật hòa tan phosphate. - Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ phân lập từ đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế. - Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của một số chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ