- DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.160 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM TỪ GỖ MỤC. - CÓ KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Nguyễn Khởi Nghĩa. - Gỗ mục, loại màu, nấm, thuốc nhuộm đen, thuốc nhuộm xanh Keywords:. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân lập và định danh một số dòng nấm phân hủy gỗ mục có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và đen. - Định tính và định lượng khả năng loại màu thuốc nhuộm được tiến hành với môi trường MT3 (Jonathan and Fasidi, 2001) bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm. - Kết quả nghiên cứu cho thấy tổng cộng 54 dòng nấm từ gỗ mục được phân lập, trong đó 12 và 15 trong số 54 dòng nấm phân lập lần lượt thể hiện khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và đen. - Hai dòng nấm ký hiệu HG1 và TV13 thể hiện khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và đen cao nhất. - Dòng nấm HG1 có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh cao nhất sau 8 ngày nuôi cấy, giảm 457 mg.L -1 , chiếm 92% nồng độ ban đầu (500 mg.L -1 ) trong khi dòng nấm TV13 có khả năng loại màu thuốc nhuộm đen tốt nhất sau 7 ngày nuôi cấy, giảm 493 mg.L -1 , chiếm 99% nồng độ ban đầu. - Kết quả giải mã trình tự đoạn gen 18S-rRNA cho thấy cả 02 dòng nấm HG1 và TV13 thuộc chi Marasmiellus. - Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm từ gỗ mục có khả năng loại màu thuốc nhuộm ở Đồng bằng sông Cửu Long. - Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp phẩm màu và hóa học thì thuốc nhuộm màu tổng hợp được sản xuất rất đa dạng về chủng loại và được sử dụng một cách rộng rãi, đặc biệt trong ngành công nghiệp dệt may (Trần Văn Nhân và Ngô Thị Nga, 2002. - Hàng năm, khoảng 280.000 tấn thuốc nhuộm được thải ra môi trường trên toàn thế giới chủ yếu từ ngành công nghiệp dệt may, các chất nhuộm màu độc hại và khó phân hủy sinh học.. - Nước thải từ ngành công nghiệp dệt may gồm hỗn hợp của nhiều chất gây ô nhiễm môi trường như muối, acid, kim loại nặng, thuốc trừ sâu chlor hữu cơ, bột màu và thuốc nhuộm. - Hiệu suất thấp trong việc nhuộm màu dẫn đến một lượng lớn thuốc nhuộm còn dư hoà vào trong nước thải, trong quá trình dệt và cuối cùng được thải ra môi trường (Farah et al., 2013). - Nhiều phương pháp đã được nghiên cứu để ứng dụng loại màu nhuộm này như keo tụ, hấp phụ và màng sinh học… Tuy nhiên, sản phẩm cuối cùng sau tiến trình xử lý vẫn còn chứa một lượng lớn bùn lắng và màu (Zolinger, 1991).. - Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu công nghệ xử lý nước thải dệt may bằng vi sinh vật được quan tâm vì mang lại hiệu quả cao và thân thiện môi trường sinh thái như Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor và Aureobasidium pullulans (Martins et al., 2003. - FBH11 (Châu Ngọc Điệp, 2010), Trametes maxima CPB30 (Dương Minh Lam và Trương Thị Chiên, 2013)… Trong đó, nấm phát triển từ gỗ mục là một trong những vật liệu được các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến trong việc loại màu nước thải nhuộm vì các dòng nấm này có chứa hệ enzyme ngoại bào chuyên biệt có khả năng phân hủy hoặc hấp thụ vào sinh khối nấm nhờ một chuỗi các tiến trình chuyển hóa sinh học (Robinson et al., 2001, Khan et al., 2013).. - có khả năng phân hủy thuốc nhuộm, lignin, thuốc trừ sâu hoặc chuyển chúng thành các sản phẩm ít độc hơn (Robinson et al., 2001. - Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân lập và tuyển chọn những dòng nấm từ gỗ mục phục vụ cho việc xử lý sinh học chất nhuộm trong nước thải từ các nhà máy dệt và thuộc da vẫn còn rất hạn chế. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có nguồn gốc bản địa trong gỗ mục để loại màu nhuộm tổng hợp trong chất thải của ngành dệt may đồng thời định danh các dòng nấm này bằng phương pháp sinh học phân tử.. - 2.2 Môi trường sử dụng để phân lập và đánh giá chức năng của nấm. - Môi trường dùng để nuôi cấy và khảo sát khả năng loại màu của nấm (MT3) (Jonathan and Fasidi, 2001) gồm Glucose 10 g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 0,5 g, CaCl 2 0,14 g, Yeast extract 1 g, Thiamine 0,0025 g hòa tan với 1L nước khử khoáng.. - Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Gams et al., 1998): Potato infusion 200 g, dextrose 20 g, agar 20 g và 1L nước khử khoáng.. - Tất cả môi trường được khử trùng 121 o C trong 20 phút.. - 2.3 Phân lập và tách ròng các dòng nấm Mẫu vật có chứa thể quả nấm sau khi thu thập được rửa sạch và tiệt trùng bề mặt lần lượt bằng cồn 96% trong 3 phút, hypochloride 1% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% (H 2 O 2 ) trong 3 phút và rửa lại bằng nước cất tiệt trùng 4 lần. - sau khi sợi nấm phát triển trên môi trường nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển liên tục 4 lần trong cùng một môi trường để tinh ròng các dòng nấm.. - 2.4 Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của 54 dòng nấm phân lập. - 2.4.1 Định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm của các dòng nấm phân lập trên môi trường MEA bổ sung thuốc nhuộm. - Thực hiện chủng từng dòng nấm đã được tinh ròng lên môi trường MEA bằng cách đặt một khối môi trường MEA (đường kính 6 mm) chứa sợi nấm phát triển tốt vào giữa đĩa petri chứa môi trường MEA có bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm đen hoặc xanh (Brilliant Black BN hoặc Bromophenol blue). - Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấm thử nghiệm. - Sau 10 ngày ủ tiến hành kiểm tra và đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của từng dòng nấm bằng cách xác định cường độ vùng mất màu nằm xung quanh khuẩn ty nấm.. - 2.4.2 Định lượng khả năng loại màu thuốc nhuộm của các dòng nấm thể hiện định tính phân giải màu thuốc nhuộm. - Tiến hành định lượng khả năng loại màu thuốc nhuộm của các dòng nấm có tiềm năng sau khi đã được định tính (12 dòng nấm loại màu thuốc nhuộm đen và 15 dòng loại màu thuốc nhuộm xanh). - Qui trình được thực hiện như sau: Hút 30 mL môi trường MT3 (Jonathan and Fasidi, 2001) có bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm đen hoặc xanh vào bình tam giác 100 mL tiệt trùng. - Ghi nhận nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nuôi cấy tại các thời điểm 0, 4, 8 ngày đối với thuốc nhuộm đen và ngày đối với thuốc nhuộm xanh. - Cách xác định hàm lượng thuốc nhuộm còn lại trong môi trường nuôi cấy: hút 2,5 mL mẫu môi trường nuôi cấy nấm tại thời điểm thu mẫu, ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút. - Sau đó, đo trên máy quang phổ với bước sóng 580 nm cho thuốc nhuộm xanh và 590 nm cho thuốc nhuộm đen. - Cuối cùng, dùng phương trình tuyến tính được thiết lập từ dãy đường chuẩn để tính nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nuôi cấy tại thời điểm thu mẫu.. - 2.4.3 Định danh 2 dòng nấm ký hiệu HG1 và TV13 có tiềm năng ứng dụng cao nhất bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Giải mã trình tự một đoạn gen 18S rRNA của dòng nấm tuyển chọn thể hiện khả năng loại màu tốt nhất đối với 2 loại thuốc nhuộm xanh và đen.. - Kết quả trình tự giải mã một đoạn gen của dòng nấm được đối chiếu với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI nhằm định danh tên khoa học của hai dòng nấm. - Từ kết quả giải trình tự, các trình tự này sẽ được so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gen NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xác định tên loài của dòng nấm khảo sát.. - 3.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm phát triển trên gỗ mục có khả năng loại màu thuốc nhuộm. - đã phân lập được 54 dòng nấm ký hiệu tương ứng cho từng địa điểm thu thập như Cần Thơ (ký hiệu CT1 CT12), Hậu Giang (HG1HG14), Trà. - Số lượng dòng nấm phân lập được cho mỗi địa điểm được trình bày trong Bảng 1.. - Bảng 1: Địa điểm và số lượng dòng nấm được phân lập. - Địa điểm Số lượng dòng nấm phân lập Tỉ lệ phân lập được. - 3.2 Đánh giá khả năng loại màu của 54 dòng nấm phân lập. - 3.2.1 Định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và đen trên môi trường MEA agar của 54 dòng nấm phân lập. - Kết quả đánh giá định tính về khả năng loại màu hai loại thuốc nhuộm xanh và đen của 54 dòng nấm trong môi trường MEA sau 10 ngày nuôi cấy được trình bày ở Bảng 2 cho thấy đối với thuốc nhuộm màu đen, kết quả ghi nhận có 12 dòng trong tổng số 54 dòng nấm phân lập thể hiện định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm đen và chiếm 22%. - Trong đó, có 7 dòng loại màu thuốc nhuộm đen hoàn toàn gồm các dòng VL8, VL13, HG1, HG14, TV5, TV13 và TV14 và chiếm 58% trong tổng số các dòng thể. - hiện định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm đen (Hình 1). - Kế đến, kết quả cũng cho thấy có 15 dòng nấm trong tổng số 54 dòng phân lập có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và chiếm 28%. - Trong đó, có 11 dòng nấm loại màu hoàn toàn thuốc nhuộm xanh gồm các dòng VL5, VL10, VL12, VL13, HG1, HG8, HG14, TV5, TV10, TV14 và CT11 và chiếm 73% trong tổng số các dòng thể hiện định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh (Hình 2). - TV13 và CT3 là hai dòng nấm loại màu thuốc nhuộm xanh cao nhất trong khi VL8 và HG2 loại màu thuốc nhuộm xanh ở mức trung bình. - Kết quả định tính khả năng loại màu thuốc nhuộm cao nhất cho thấy dòng nấm TV13 và HG1 có khả năng loại màu thuốc nhuộm đen và thuốc nhuộm xanh hiệu quả nhất trên môi trường MEA.. - Hình 1: Khả năng loại màu thuốc nhuộm đen trên môi trường MEA của dòng nấm TV13 sau 10 ngày nuôi cấy: (a) đối chứng không chủng nấm và (b) chủng dòng nấm TV13. - Hình 2: Khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh trên môi trường MEA của dòng nấm TV14 sau 10 ngày nuôi cấy: (a) đối chứng không chủng nấm và (b) chủng dòng nấm TV14. - Bảng 2: Khả năng loại màu thuốc nhuộm đen hoặc xanh của 15 dòng tuyển chọn từ tổng số 54 dòng nấm phân lập trên môi trường MEA bổ sung thuốc nhuộm sau 10 ngày nuôi cấy. - Vùng loại màu thuốc nhuộm. - *Ghi chú: Phân cấp các mức độ loại màu thuốc nhuộm như sau. - 3.2.2 Định lượng khả năng loại màu thuốc nhuộm của các dòng nấm chọn lọc trong môi trường MT3 (Jonathan và Fasidi, 2001). - Kết quả đánh giá về khả năng loại màu hai loại thuốc nhuộm xanh và đen của 15 dòng nấm trong môi trường MT3 (Jonathan and Fasidi, 2001) bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm đen hoặc xanh cho thấy 15 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng loại màu thuốc nhuộm hiệu quả thông qua việc ghi nhận nồng độ thuốc nhuộm giảm dần theo thời gian nuôi cấy.. - Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh sau 8 ngày nuôi cấy của 15 dòng nấm định tính được trình bày trong Hình 3.. - Nhìn chung, tất cả các dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng loại bỏ thuốc nhuộm màu xanh rất tốt, nồng độ thuốc nhuộm xanh phân hủy dao động từ 125-460 mg.L -1 và đều khác biệt ý nghĩa thống kê (p<. - Trong đó, dòng nấm HG1 có nồng độ thuốc nhuộm xanh còn lại trong môi trường nuôi cấy thấp nhất ở tất cả các thời điểm thu mẫu và chỉ còn 43 mg.L -1 sau 8 ngày nuôi cấy. - Tóm lại, mười lăm dòng nấm thử nghiệm đều cho khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh tốt và dòng nấm HG1 thể hiện khả năng phân hủy cao nhất đối với thuốc nhuộm xanh (Hình 4).. - Hình 3: Khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh của 7 dòng nấm tiêu biểu nhất trong tổng số 15 dòng thử nghiệm trong môi trường MT3 bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm xanh sau 8 ngày nuôi cấy (n=3,. - Hình 4: Khả năng loại màu hoàn toàn thuốc nhuộm xanh của dòng nấm HG1 sau 8 ngày nuôi cấy trong môi trường MT3 bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm xanh so với nghiệm thức đối chứng không. - chủng nấm Đối với thí nghiệm loại màu thuốc nhuộm đen. - kết quả được trình bày ở Hình 5 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy tất cả 12 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng phân hủy thuốc nhuộm đen rất tốt, nồng độ thuốc nhuộm phân hủy dao động từ 240- 490 mg.L -1 và đều khác biệt ý nghĩa thống kê (p<. - Tuy nhiên, ba dòng nấm CT3, VL13 và TV13 thể hiện khả năng. - loại màu thuốc nhuộm đen tốt hơn so với các dòng nấm còn lại với nồng độ thuốc nhuộm đen trong môi trường nuôi cấy giảm mạnh ở giai đoạn 3 đến 7 ngày nuôi cấy. - Trong đó, sau 7 ngày nuôi cấy, nồng độ thuốc nhuộm đen còn lại trong môi trường nuôi cấy của dòng TV13 thấp nhất tương ứng với 7 mg.L -1 (Hình 6).. - Hình 5: Khả năng loại màu thuốc nhuộm đen của 5 dòng nấm tiêu biểu nhất trong tổng số 12 dòng nấm thử nghiệm trong môi trường MT3 có bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm đen sau 7 ngày nuôi cấy. - (n=3, sai số chuẩn) Kết quả nghiên cứu về khả năng loại màu thuốc. - nhuộm của các dòng nấm phân lập tương tự với kết quả nghiên cứu của Yesilada et al., (2003) đối với loài Pleurotus ostreatus với 3 loại thuốc nhuộm đỏ, xanh và đen lần lượt 97, 89 và 84% ở nồng độ 264 mg.L -1 . - Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Kalmis et al., (2008) trên hai loài nấm phân lập Pleurotus ostreatus MCC020 và MCC007 có khả năng loại màu thuốc nhuộm đen rất tốt ở nồng độ. - 1000 mg.L -1 với tỷ lệ loại màu tương ứng với 83,6 và 81,8%. - Ngoài ra, loài nấm Aspergillus niger đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào ligninase giúp phân hủy hợp chất cao phân tử lignin thông qua phản ứng oxi hóa nhằm chuyển 3,4 dimethoxybenzyl alcohol thành veratyldehyde dưới sự hiện diện của H 2 O 2. - Hình 6: Khả năng loại màu thuốc nhuộm đen của dòng nấm TV13 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MT3 bổ sung 500 mg.L -1 thuốc nhuộm đen so với nghiệm thức đối chứng không chủng nấm. - 3.3 Kết quả giải mã trình tự một đoạn gen 18S rRNA và định danh tên khoa học của hai dòng nấm có tiềm năng ứng dụng cao nhất bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của cả hai dòng nấm HG1 và TV13 tương đồng với đoạn gen 18S rRNA của loài nấm Marasmiellus palmivorus với tính đồng hình 100% và độ bao phủ tương ứng lần lượt 100% và 95%. - Như vậy, hai dòng nấm có khả năng loại màu thuốc nhuộm này đều thuộc chi Marasmiellus và được định danh là Marasmiellus sp. - Tuy nhiên, dựa vào thông tin tài liệu tham khảo của các nghiên cứu trước đây cho thấy chưa có nghiên cứu nào công bố loài nấm Marasmiellus palmivorus có khả năng loại màu thuốc nhuộm, duy nhất chỉ có nghiên cứu của Chenthamarakshan et al. - Do đó, nghiên cứu này bổ sung vào kiến thức về hai dòng nấm thuộc chi Marasmiellus trong tự nhiên có khả năng loại màu của thuốc nhuộm với hiệu quả cao.. - Bảng 3: Tóm tắt kết quả định danh hai dòng nấm loại màu thuốc nhuộm HG1 và TV13 TT Dòng Nguồn gốc Độ đồng. - Các dòng nấm trên. - Quả thể nấm được thu thập trên cây gỗ mục tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như Cần Thơ, Hậu Giang, Trà Vinh và Vĩnh Long để phân lập và làm thuần các dòng nấm có khả năng loại màu thuốc nhuộm trong ngành dệt may. - Đã phân lập được 54 dòng nấm từ gỗ mục. - trong tổng số 54 dòng nấm thể hiện chức năng loại màu thuốc nhuộm đen và 15 trong tổng số 54 dòng nấm phân lập loại màu thuốc nhuộm xanh. - Từ các dòng nấm trên đã chọn được 02 dòng nấm có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh và đen cao nhất lần lượt HG1 và TV13. - Dòng nấm HG 1 được thu thập tại Hậu Giang có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh cao nhất sau 8 ngày nuôi cấy, nồng độ. - thuốc nhuộm giảm còn 43 mg.L -1 và dòng nấm TV13 thu thập tại Trà Vinh có khả năng loại màu thuốc nhuộm đen tốt nhất sau 7 ngày nuôi cấy, nồng độ thuốc nhuộm giảm còn 7 mg.L -1 so với ban đầu 500 mg.L -1 . - Kết quả giải mã trình tự đoạn gen 18S rRNA với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen thế giới bằng chương trình BLAST cho thấy cả 02 dòng nấm HG1 và TV13 tương đồng với đoạn gen 18S rRNA của nấm Marasmiellus palmivorus với độ đồng hình 100% và độ bao phủ tương ứng 95% và 100%. - TV13 và cả hai dòng nấm này có tiềm năng ứng dụng cao trong loại bỏ màu nước thải của các nhà máy dệt nhuộm.. - Hoá học thuốc nhuộm. - Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase, phân huỷ thuốc nhuộm từ chủng nấm Aspergillus sp. - Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm đảm Trametes maxima CPB30 sinh laccase ứng dụng trong loại màu nước ô nhiễm do thuốc nhuộm. - Nghiên cứu phương pháp thích hợp để khử màu thuốc nhuộm hoạt tính trong nước thải dệt nhuộm