Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn từ lá thực vật có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng

- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN TỪ LÁ THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG.
- Curtobacterium citreum, Curtobacterium luteum, phân lập, vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng, vi khuẩn lá thực vật.
- Nghiên cứu thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng từ lá thực vật.
- Môi trường nuôi cấy ammonium mineral salt (AMS) được sử dụng để phân lập vi khuẩn.
- Kết quả đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn từ lá của 6 loài thực vật khác nhau gồm mồng tơi (Basella rubra L.
- Các chỉ tiêu về tỉ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, chiều cao chồi và số rễ của hạt bắp được khảo sát để đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng của các dòng vi khuẩn phân lập.
- Các dòng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc và tế bào rất đa dạng..
- Hai dòng vi khuẩn ký hiệu HH5 và MT6 làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm và sinh trưởng của hạt bắp tốt nhất trong các dòng vi khuẩn phân lập.
- Bên cạnh đó, nghiên cứu còn cho thấy ở mật số 10 6 CFU.mL -1 cả hai dòng vi khuẩn giúp gia tăng tỉ lệ nảy mầm và sinh trưởng của cây bắp tốt hơn so với mật số và 10 9 CFU.mL -1 .
- Kết giải mã trình tự đoạn gene 16S rRNA cho thấy hai dòng vi khuẩn HH5 và MT6 lần lượt có mối quan hệ gần gũi với loài Curtobacterium citreum và Curtobacterium luteum..
- Trong số đó, nhóm vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium và Curtobacterium đã được công bố là có tiềm năng ứng dụng rất lớn.
- Vi khuẩn Methylobacterium sp.
- Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn thuộc chi Curtobacterium có mối liên quan mật thiết đến thực vật và đặc biệt là nằm trên bề mặt thực vật (Behrendt et al., 2002;.
- Dòng vi khuẩn Curtobacterium herbarum đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển ở cây hoa cải, rau diếp, húng quế và cải ngọt (Mayer et al., 2019).
- Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn từ lá một số loài thực vật có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng..
- Phân lập vi khuẩn từ lá thực vật có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng 2.1.1.
- Tổng cộng 16 mẫu lá thực vật khác nhau dùng làm nguồn vi khuẩn để phân lập vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng gồm bắp (Zea mays L.
- Đặt đĩa petri chứa vi khuẩn trong tối trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
- Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, đến khi khuẩn lạc vi khuẩn màu hồng phát triển tốt.
- chứa 20 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn với mật số 10 6 CFU.mL -1 và ngâm trong 16 giờ.
- Mỗi Falcon chứa vi khuẩn tương ứng với 1 lặp lại và thí nghiệm được bố trí với 3 lặp lại cho mỗi hệ vi khuẩn lá khác nhau.
- Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn vào trong hạt bắp..
- Tách ròng và tinh sạch các dòng vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng từ các dòng vi khuẩn thể hiện khả năng kích thích sinh trưởng cây bắp tốt nhất.
- Dựa vào kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của 16 hệ vi khuẩn phân lập từ 16 mẫu lá thực vật khác nhau ở mục 2.1.3 chọn ra các hệ vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây bắp tốt nhất để tách ròng và tinh sạch các dòng vi khuẩn..
- Sau đó hút 50 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng này và trải lên trên đĩa môi trường khoáng AMS agar bằng que chà.
- Quan sát khuẩn lạc phát triển trên môi trường nuôi cấy và tiến hành chọn các khuẩn lạc rời có hình thái và màu sắc khuẩn lạc khác nhau để cấy chuyển liên tục 4-5 lần trên môi trường AMS agar để thu được các dòng vi khuẩn thuần.
- Các dòng vi khuẩn phân lập được mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng như nhuộm Gram vi khuẩn.
- Đồng thời, khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn này được trữ trong glycerol 30% ở - 30 o C cho các thí nghiệm tiếp theo..
- Khảo sát và đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây bắp của các dòng vi khuẩn phân lập.
- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn.
- Cho 1 khuẩn lạc vi khuẩn của các dòng vi khuẩn thử nghiệm vào trong bình tam giác 100 mL chứa 30 mL AMS lỏng tiệt trùng để nhân mật số.
- Các bình tam giác chứa vi khuẩn được đặt trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong 2 ngày và trong tối..
- Thí nghiệm được bố trí tương tự như mục 2.1.3 nhưng các hệ vi khuẩn được thay bằng các dòng vi khuẩn.
- Mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức được thực hiện với 3 lần lặp lại và mỗi lặp lại có 10 hạt bắp.
- Nghiệm thức chủng nước cất tiệt trùng không chứa vi khuẩn vào trong hạt bắp được xem như là nghiệm thức đối chứng.
- Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của các mật số vi khuẩn khác nhau của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn lên tỉ lệ nảy mầm hạt bắp ở điều kiện phòng thí nghiệm 2.3.1.
- Việc chuẩn bị nguồn vi khuẩn của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn được thực hiện như mục 2.2.1 và mật số của mỗi dòng vi khuẩn được hiệu chỉnh về 4 nồng độ gồm và 10 9 CFU.mL -1.
- Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng và 4 nghiệm thức chứa 4 mật số vi khuẩn khác nhau gồm và 10 9 CFU.mL -1 .
- Định danh hai dòng vi khuẩn tuyển chọn thể hiện khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng tốt nhất bằng phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rRNA DNA của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng tốt nhất được tách chiết bằng phương pháp sử dụng CTAB 3%.
- DNA của hai dòng vi khuẩn được khuếch đại gene 16S-rRNA với cặp mồi được sử dụng là: 27F (5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3.
- Kết quả giải trình tự được so sánh và dò tìm trên ngân hàng gene thế giới trên trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để định danh khoa học hai dòng vi khuẩn tuyển chọn..
- Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của 16 hệ vi khuẩn sau 4 ngày thí nghiệm được trình bày ở Hình 1..
- Kết quả cho thấy tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp sau 2 ngày thí nghiệm hầu hết ở tất cả các nghiệm thức chủng với 16 hệ vi khuẩn phân lập từ 16 mẫu lá thực vật (trừ nghiệm thức chủng với hệ vi khuẩn từ lá cải xanh và lá dừa) cao hơn khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (p<0,05).
- Trong đó nghiệm thức chủng hệ vi khuẩn từ lá cây hoa hồng cho tỉ lệ nảy mầm cao nhất, đạt 80% và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại.
- Các nghiệm thức chủng hệ vi khuẩn từ lá cây chiều tím, bình bát dây, cơm nguội, cỏ đậu và mồng tơi có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp dao động trong khoảng từ 73,3.
- này, tiến hành chọn 6 hệ vi khuẩn từ lá hoa hồng,.
- bình bát dây, cơm nguội, cỏ đậu, chiều tím và mồng tơi để tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng..
- Tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp của các nghiệm thức chủng 16 hệ vi khuẩn từ lá thực vật (n=3) Ghi chú: Những số có chữ theo sau khác nhau thì có khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và gram của 28 dòng vi khuẩn phân lập từ 6 hệ vi khuẩn lá thực vật có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng tốt nhất.
- Kết quả mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và gram của 28 dòng vi khuẩn phân lập được trình bày trong Bảng 1 và Hình 2.
- Kết quả cho thấy đa số các dòng vi khuẩn là Gram dương, hình que ngắn, khuẩn lạc tròn, bóng và màu sắc khuẩn lạc từ trắng, trắng đục, vàng và hồng.
- Khuẩn lạc của vi khuẩn sau 2 ngày có kích thước dao động 0,1-0,8 mm (Hình 2)..
- Hình thái khuẩn lạc và tế bào của một số dòng vi khuẩn phân lập tiêu biểu.
- Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng cây bắp của 28 dòng vi khuẩn phân lập sau 4 ngày thí nghiệm được trình bày trong Bảng 2.
- Trong đó, nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn có tỉ lệ nảy mầm đạt 53,3%.
- Các nghiệm thức chủng với dòng vi khuẩn ký hiệu BBD1, BBD2, BBD3, BBD4, CĐ1, CĐ2, CĐ5, CN3, CT, HH1, HH4, HH6, MT1, MT2, MT4, MT5, MT7 có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê khi so sánh với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.
- Kết quả này cho thấy các dòng vi khuẩn này không giúp kích thích gia tăng cũng không làm ức chế tỉ lệ này mầm của hạt bắp.
- Bên cạnh đó, các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn ký hiệu CĐ6, CN2, CN4 và HH3 có tỉ lệ nảy mầm thấp hơn, khác biệt ý nghĩa.
- thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng, không chủng vi khuẩn và đạt 43,3%.
- Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn này đã ức chế sự nảy mầm của hạt bắp.
- Trong khi đó các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn ký hiệu CĐ3, CĐ4, CN1, HH1, HH5, MT3 và MT6 có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp cao hơn, khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng và dao động trong khoảng từ 63,3.
- Trong số các dòng vi khuẩn kích thích tỉ lệ nảy mầm hạt bắp, hai nghiệm thức chủng hai dòng vi khuẩn ký hiệu HH5 và MT6 có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp cao nhất, đều đạt 73,3% và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với tất cả các nghiệm thức còn lại.
- Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kiều Phương Nam (2010) cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập Methylobacterium spp.
- một số dòng vi khuẩn thử nghiệm không có chức năng kích thích gia tăng cũng không ức chế các chỉ tiêu sinh trưởng này.
- Trong khi một số dòng vi khuẩn thử nghiệm có chức năng ức chế sự phát triển về các chỉ tiêu sinh trưởng này và cuối cùng có một số dòng vi khuẩn thử nghiệm có chức năng kích thích làm gia tăng các chỉ tiêu sinh trưởng này..
- Trong đó, đặc biệt một lần nữa hai nghiệm thức chủng 2 dòng vi khuẩn thử nghiệm ký hiệu HH5 và MT6 có chiều dài rễ chính, số rễ và chiều cao chồi cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại.
- Kết quả nghiên cứu của Kiều Phương Nam (2009) cho thấy dòng vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 phân lập từ lá.
- Nghiên cứu này cũng cho thấy vi khuẩn M..
- Trên môi trường cảm ứng tạo rễ, việc bổ sung dòng vi khuẩn này có tác dụng rút ngắn thời gian hình thành rễ, số rễ nhiều hơn và chiều dài rễ dài hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.
- Kết quả này cho thấy 2 dòng vi khuẩn ký hiệu HH5 và MT6 có thể được xem như là hai dòng vi khuẩn phân lập có khả năng kích thích sinh trưởng hạt bắp tốt nhất và được chọn để thực hiện các nghiên cứu kế tiếp..
- Ảnh hưởng của việc chủng 28 dòng vi khuẩn phân lập lên sinh trưởng cây bắp ở điều kiện phòng thí nghiệm (n=3).
- Ảnh hưởng của các mật số vi khuẩn khác nhau của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn HH5 và MT6 lên tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp ở điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mật số vi khuẩn khác nhau của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn HH5 và MT6 lên tỉ lệ nảy mầm hạt bắp được trình bày ở Hình 3..
- Kết quả cho thấy việc chủng 2 dòng vi khuẩn HH5 và MT6 ở nồng độ 10 6 CFU.mL -1 giúp gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp.
- Đối với dòng vi khuẩn HH5, nghiệm thức chủng mật số 10 6 CFU.mL -1 có tỉ lệ nảy mầm cao nhất, khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại và đạt 93,3%.
- Các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn này với mật số 10 7 CFU.mL -1 , 10 8 CFU.mL -1 , 10 9 CFU.mL -1 có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp thấp hơn so với nghiệm thức chủng vi khuẩn HH5 ở mật số 10 6 CFU.mL -1 , lần lượt đạt và 76,7% và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p>0,05) khi so sánh với nhau và với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (73,3.
- khuẩn HH5, dòng vi khuẩn tuyển chọn MT6 với nghiệm thức chủng mật số 10 6 CFU.mL -1 cũng cho tỉ lệ nảy mầm hạt bắp cao nhất, đạt 93,3% và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (73,3%) và nghiệm thức chủng với mật số 10 9 CFU.mL .
- Trong khi nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MT6 ở mật số 10 6 CFU.mL -1 có tỉ lệ nảy mầm hạt bắp khác biệt không ý nghĩa thống kê (p>0,05) khi so với các nghiệm thức chủng ở mật số 10 7 CFU.mL và 10 8 CFU.mL -1 (86,7.
- Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kiều Phương Nam (2010) cho thấy các dòng vi khuẩn Methylobacterium spp.
- Tóm lại kết quả thí nghiệm này cho thấy mật số 10 6 CFU.mL -1 là mật số thích hợp nhất để chủng hai dòng vi khuẩn HH5 và MT6 vào hạt bắp giúp gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt và có thể với mật số 10 6 CFU.mL -1 này vi khuẩn tổng hợp ra lượng phytorhormone vừa đủ để giúp kích thích tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp tốt nhất..
- Tỉ lệ nảy mầm của hạt bắp khi chủng với dòng vi khuẩn HH5 (A) và MT6 (B) ở các mật số vi khuẩn khác nhau (n=3).
- Định danh hai dòng vi khuẩn tuyển chọn HH5 và MT6 có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng tốt nhất bằng phương pháp giải mã trình tự đoạn gene 16S rRNA.
- Hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn HH5 và MT6 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng hạt bắp tốt nhất được phân lập từ lá cây hoa hồng và cây mồng tơi.
- Hai dòng vi khuẩn này đều là vi khuẩn gram dương, tế bào dạng hình que và khuẩn lạc có dạng.
- kết quả cho thấy trình tự đoạn gene của 2 dòng vi khuẩn HH5 và MT6 lần lượt tương đồng với đoạn gene 16S rRNA của 2 loài vi khuẩn Curtobacterium citreum và Curtobacterium luteum với tính đồng hình lần lượt là 99% và 100%.
- dòng vi khuẩn này theo Yamada and Komagata (1972) cho thấy hai dòng vi khuẩn này đều có khuẩn lạc tròn, màu vàng nghệ, tế bào dạng hình que ngắn và thật sự giống với hình thái khuẩn lạc và tế bào của hai dòng vi khuẩn HH5 và MT6.
- dòng vi khuẩn tuyển chọn này đều được nhận dạng như là hai dòng vi khuẩn thuộc chi vi khuẩn Curtobacterium và được định danh là Curtobacterium citreum HH5 và Curtobacterium luteum MT6 (Bảng 3)..
- Tóm tắt kết quả định danh 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn HH5 và MT6 STT Dòng Độ đồng.
- Vi khuẩn Các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu Số đăng kí Định danh.
- Các vi khuẩn thuộc chi Curtobacterium là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí bắt buộc (Evtushenko.
- Takeuchi, 2006), vi khuẩn không hình thành bào tử, do đó vi khuẩn thuộc chi Curtobacterium sống sót kém trong đất (Vidaver, 1982).
- Hầu hết vi khuẩn Curtobacterium có tác động tích cực đến sinh trưởng ở thực vât ngoại trừ dòng vi khuẩn C..
- flaccumfaciens là loài vi khuẩn thuộc chi Curtobacterium duy nhất gây bệnh ở thực vật (Young et al., 1996)..
- Các hệ vi khuẩn có nguồn gốc từ lá 16 loài thực vật khác nhau trong nghiên cứu này đều có khả năng kích thích gia tăng tỉ lệ nảy mầm và sinh trưởng của cây bắp.
- Từ 6 hệ vi khuẩn lá thực vật ưu tú nhất được tuyển chọn để phân lập vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn.
- Trong đó, 2 dòng vi khuẩn ký hiệu HH5 và MT6 có nguồn gốc từ lá cây hoa hồng và cây mồng tơi thể hiện khả năng kích thích sinh trưởng cây bắp tốt nhất thông qua các chỉ tiêu về tỉ lệ nảy mầm, chiều dài rễ chính, số rễ và chiều cao chồi.
- Khả năng kích thích tỉ lệ nảy mầm hạt bắp tốt nhất của 2 dòng vi khuẩn này được xác định ở mật số 10 6 CFU.mL -1 .
- Dựa vào kết quả giải trình tự đoạn gene 16S RNA cả 2 dòng vi khuẩn được nhận dàng đều thuộc chi Curtobacterium và được định danh như Curtobacterium citreum HH5 và Curtobacterium luteum MT6.
- Cả 2 dòng vi khuẩn này có tiềm năng ứng dụng cao trong việc tạo ra chế phẩm sinh học kích thích sinh trưởng cây trồng và thân thiện với môi trường..
- Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự phát sinh cơ quan ở thực vật.
- Khả năng ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium spp