- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM TỪ BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei). - Oxy hóa ammonia, oxy hóa nitrite, vi khuẩn chuyển hóa đạm. - Nghiên cứu về phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm thẻ chân trắng được thực hiện nhằm bổ sung vào bộ sưu tập vi khuẩn hữu ích phục vụ nuôi trồng thủy sản. - Trong nghiên cứu này, 121 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa đạm đã được phân lập, chúng có nguồn gốc từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng. - Đa số các chủng vi khuẩn này có dạng que ngắn, Gram âm và chuyển động. - Trong số đó, chủng TB7.2 có khả năng oxy hóa ammonia tốt nhất đạt 39,02%, và chủng TV4.2 có hiệu suất oxy hóa nitrite đạt đến 27,8% sau 5 ngày. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). - NO 2 - với hàm lượng cao có thể gây độc cho tôm, cá. - Nitrate là sản phẩm tiếp theo của quá trình oxy hóa nitrite, với hàm lượng vượt quá 10 mg/L gây nên sự phú dưỡng, ảnh hưởng lớn đến môi trường thủy sản (Boyd, 1989). - Hiện nay, rất nhiều chế phẩm sinh học đã xuất hiện trên thị trường với thành phần chủ yếu là các dòng vi khuẩn thuộc các chi Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter. - các dòng này có khả năng phân giải protein thành các polypeptide, amino acid, NH 3. - Để góp phần trong công tác nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học ứng dụng trong thủy sản bằng cách tìm ra những dòng vi khuẩn bản địa và để tiến tới một nền thủy sản bền vững, giảm ô nhiễm môi trường, giảm chi phí sản xuất và tăng thu nhập cho người nuôi, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)” được thực hiện.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thu mẫu bùn. - 2.2 Phương pháp phân lập và nuôi tăng sinh vi khuẩn. - Phương pháp phân lập và nuôi tăng sinh vi khuẩn từ mẫu bùn được mô tả bởi Chankaew et al. - 100 mL và nuôi ở 28⁰C trên máy lắc với vận tốc 160 rpm (vòng/phút) trong điều kiện che tối để nuôi tăng sinh mật độ vi khuẩn oxy hóa đạm ammonium trước khi phân lập. - Sau 7 ngày nuôi, tiến hành pha loãng mẫu và phân lập vi khuẩn trên môi trường AOB (bổ sung 1% NaCl và 1,5% Agar. - Sau đó, các khuẩn lạc thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường AOB lỏng ở 28⁰C, lắc 160 rpm trong 7 ngày để tiến hành nghiên cứu sàng lọc. - Thực hiện tương tự với vi khuẩn oxy hóa nitrite trên môi trường NOB gồm các thành phần khoáng cơ bản như trên môi trường AOB được thay thế (NH 4 ) 2 SO 4 thành NaNO 2 (Spieck and Bock, 2005).. - 2.3 Phương pháp xác định hình dạng, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập. - Hình dạng kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993).. - Vi khuẩn cho phản ứng dương tính với Catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí và ngược lại.. - Phản ứng oxidase: phết một ít vi khuẩn lên đĩa giấy đã tẩm dung dịch tetramethyl- p- phenylenediamine dihydrochloride (1%) bằng que cấy vô trùng. - Vi khuẩn cho phản ứng dương tính sẽ làm giấy chuyển sang màu đen và ngược lại.. - Tính di động: nhỏ một giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy vô trùng trải đều vi khuẩn lên lam, đậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi vật kính 40X. - Xác định khả năng sinh bào tử: dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn trước khi cấy trên môi trường chuyên biệt AOB và NOB (bổ sung 1,5%. - Sau khi ủ ở nhiệt độ 28⁰C trong 48 giờ, nếu vi khuẩn phát triển thì vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và ngược lại.. - 2.4 Phương pháp sàng lọc các chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm. - Các chủng vi khuẩn phân lập được sàng lọc bằng phương pháp phản ứng màu với thuốc thử Griess- Ilosvay (Yang et al., 2011). - Cụ thể, nhỏ 1 giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa 5 mL huyền phù vi khuẩn oxy hóa ammonia nuôi sau 7 ngày. - định nồng độ TAN bằng phương pháp chuẩn (APHA et al., 2005) để đánh giá hiệu quả chuyển hóa đạm và trữ lạnh ở -80⁰C với 25% glycerol cho các nghiên cứu sau. - Tiến hành tương tự đối với vi khuẩn oxy hóa nitrite, tuy nhiên chọn những ống âm tính với thuốc thử cho phản ứng không màu hoặc màu nhạt nhất và xác định nồng độ NO 2 - bằng phương pháp Sulphanilamide (APHA et al., 2005).. - 2.5 Đánh giá khả năng chuyển hóa đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Chọn 5 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa mạnh nhất để đánh giá khả năng chuyển hóa đạm theo phương pháp Chankaew et al. - Tiến hành tương tự đối với vi khuẩn oxy hóa nitrit trên môi trường NOB đã điều chỉnh nồng độ N-NO 2 - 100 mg/L. - Khả năng oxy hóa ammonia được đánh giá thông qua hàm lượng TAN trong 5 mẫu nghiên cứu theo thời gian. - Chủng vi khuẩn nào có khả năng oxy hóa ammonia tốt thì hàm lượng TAN có xu hướng giảm sau 5 ngày nghiên cứu, ngược lại đối với chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite được đánh giá thông qua hàm lượng N-NO 2 - giảm theo thời gian nghiên cứu.. - 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa đạm. - Từ 32 mẫu bùn đáy của 32 ao nuôi tôm thẻ chân trắng khác nhau đã phân lập được 121 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường thạch chọn lọc (Bảng 1). - Trong đó, 58 chủng có khả năng phát triển trên môi trường AOB, 63 chủng có khả năng phát triển trên môi trường NOB.. - Bảng 1: Địa điểm và số lượng các chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm. - 3.2 Đặc điểm hình dạng, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn. - Bảng 2: Đặc điểm khuẩn lạc của 121 chủng vi khuẩn phân lập. - 3.2.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn. - Kết quả quan sát tiêu bản nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X thu được kết quả như sau: 56/58 chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường AOB (chiếm 96,6. - 62/63 chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường NOB (chiếm 98,4%) là vi khuẩn Gram âm, trong đó các chủng vi khuẩn được phân lập trên cả 2 môi trường có tế bào hình que ngắn chiếm tỉ lệ cao nhất (Bảng 3).. - Bảng 3: Đặc điểm tế bào của các chủng phân lập. - Các chủng vi khuẩn phân lập được đều không có khả năng sinh bào tử. - Trong số 58 chủng phân lập trên môi trường AOB, 39 chủng có khả năng di động, 42 chủng có phản ứng oxidase dương tính và. - 19 chủng có phản ứng catalase dương tính Trong số 63 chủng phân lập trên môi trường NOB, 54 chủng có khả năng di động, 56 chủng có phản ứng oxidase dương tính và 14 chủng có phản ứng catalase dương tính.. - 3.3 Sàng lọc các chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm tiềm năng. - Tiến hành sàng lọc 118 chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm phân lập được dựa theo mô tả hình thái và nhuộm Gram của Pillay et al. - Sau đó tiến hành đo nồng độ TAN và -NO 2 - kết quả xác định được 5 chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa đạm ammonia cao nhất lần lượt là CN8.1 (69,8. - TV và 5 chủng oxy hóa nitrite CN7.1, CN6.2, TB3.2, TB7.1, TV4.2 tương ứng với tỉ lệ chuyển hóa cao nhất là 74,7%. - cho nghiên cứu tiếp theo (Bảng 4).. - Bảng 4: Các chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm tiềm năng. - Chủng Nguồn gốc Oxy hóa ammomia. - Chủng Nguồn gốc Oxy hóa nitrite. - 3.4 Khả năng chuyển hóa đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - 3.4.1 Khả năng oxy hóa ammonia của các chủng vi khuẩn tiềm năng. - Biến động hàm lượng TAN. - Kết quả cho thấy sau 5 ngày nghiên cứu, hàm lượng TAN của chủng vi khuẩn nghiên cứu giảm. - Trong đó thí nghiệm với chủng TB7.2 có kết quả hàm lượng TAN giảm đi nhiều nhất từ mg/L xuống còn mg/L (tỷ lệ giảm đạt 39,02. - ngược lại đối với chủng TV3.1 có tỷ lệ chuyển hóa thấp nhất đạt 33,06% (từ 59,5 ± 4 mg/L còn mg/L), giữa các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05).. - Bảng 5: Kết quả hàm lượng TAN biến động sau 5 ngày nghiên cứu. - Biến động hàm lượng N-NO 2. - Điều này có thể do vi khuẩn chuyển hóa nitrite đã phát triển làm cho NO 2 - giảm nhanh. - Kết quả nghiên cứu này có hiệu suất thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Thị Trúc Mai (2019), ba dòng vi khuẩn gồm BLS1.3, BLW2.2 và BLW2.4 phân lập từ ao nuôi tôm ở tỉnh Bạc Liêu có khả năng chuyển hóa nitrite cao và đạt trên 56,3% sau bảy ngày nuôi cấy, trong đó dòng vi khuẩn BLW2.2 có hiệu suất chuyển hóa nitrite cao nhất, đạt 97,2% sau ba ngày nuôi cấy.. - Tương ứng với hàm lượng TAN ít nhất, chủng TB7.2 đạt nồng độ N-NO mg/L cao. - Dựa trên đánh giá sơ bộ đặc điểm hình thái và hoạt tính oxy hóa ammonium đã tuyển chọn được chủng TB7.2 có khả năng oxy hóa mạnh ammonia sau 5 ngày nuôi đạt hiệu suất chuyển hóa 39,02%. - Kết hợp các kết quả nghiên cứu về đặc điểm nhận dạng bằng phép thử sinh hóa chủng có hoạt tính oxy hóa amonia cao nhất đạt 79,1% của Hoàng Phương Hà và ctv. - và hiệu suất oxy hóa ammonia có phần thấp hơn. - So với nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và ctv. - (2012) vẫn có kết quả thấp hơn, sau 7 ngày nuôi chủng AO 10 có khả năng oxy hóa ammonia . - Bảng 6: Biến động hàm lượng N-NO 2 - sau 5 ngày nghiên cứu. - 3.4.2 Khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chọn lọc. - Kết quả đánh giá cho thấy hàm lượng nitrite giảm mạnh về cuối đợt thí nghiệm nhưng không theo xu hướng liên tục (Bảng 6). - Tuy nhiên, đến ngày 5 thì các chủng vi khuẩn vẫn có khả năng xử lý nitrite rất tốt như TB7.1 và TV4.2 tương ứng với. - Bảng 6: Kết quả hàm lượng N-NO 2 - biến động sau 5 ngày nghiên cứu. - Biến động hàm lượng N-NO 3. - Qua quá trình khảo sát, hàm lượng N-NO 3 - biến động và tăng nhanh ở 3 ngày cuối, riêng ngày thứ 4. - Cuối giai đoạn thí nghiệm, chủng TV4.2 có hàm lượng N-NO 3 - cao nhất đạt giá trị từ mg/L lên đến mg/L và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với. - Chủng CN6.2 đạt hàm lượng N-NO 3 - thấp nhất là 7,8 mg/L mg/L mg/L), khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với dòng TV4.2 và CN7.1 nhưng không có ý nghĩa so với dòng TB7.1 và TB3.2. - Như vậy, sau khi xác định hoạt tính của 5 chủng vi khuẩn thí nghiệm, tuyển chọn được chủng. - TV4.2 có khả năng oxy hóa nitrite 27,8%, thuộc nhóm trực khuẩn Gram âm. - Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Hoàng Phương Hà và ctv.. - (2008), chủng oxy hóa nitrite cao nhất 79,2%. - Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và ctv. - (2012), chủng vi khuẩn có ký hiệu NO 2 có khả năng oxy hóa nitrite . - Bảng 7: Biến động hàm lượng N-NO 3 - sau 5 ngày nghiên cứu. - Hình 1: Hình dạng chủng vi khuẩn oxy hóa ammonia TV 7.2. - Hình 2: Hình dạng chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite TV4.2. - Từ 121 chủng vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm tiềm năng làm cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh gồm TB7.2 tương ứng với hiệu suất oxy hóa ammonia cao nhất 39,02% và hàm lượng NO 2 - sinh ra là 0,11 mg/L. - Chủng TV4.2 có khả năng oxy hóa nitrite đạt hiệu suất 27,8% với hàm lượng nitrate sinh ra nhiều nhất, đạt 7,8 mg/L sau 5 ngày nghiên cứu.. - Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh các chủng vi khuẩn tiềm năng, đồng thời nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh nhằm ứng dụng trong việc xử lý môi trường ao nuôi thủy sản.. - Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật. - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I.. - Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại Quảng Bình và Hà Tĩnh.. - Phân lập vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrite trong một số ao nuôi tôm ở Bạc Liêu. - Phân lập và sang lọc vi khuẩn nitrat hóa để xử lý nước trong nuôi trồng thủy sản. - Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)