- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VÀ HÓA HƯỚNG ĐỘNG THEO DẦU NHỚT. - Dầu nhớt, hóa hướng động, khoáng hóa, phân lập, vi khuẩn. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng khoáng hóa và hóa hướng động theo dầu nhớt. - Từ ba mẫu đất nhiễm dầu nhớt thu ở nội ô Thành phố Cần Thơ, 43 dòng vi khuẩn (gồm 27 dòng Gram âm và 16 dòng Gram dương) phát triển trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung dầu nhớt (1%. - Các dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh trưởng trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Tween 80 (1% v/v), trong đó, 3 dòng GS20, GS21 và GS38 có khả năng phát triển mật số nhanh hơn so với các dòng vi khuẩn khác.. - Kết quả khảo sát khả năng hóa hướng động của 3 dòng vi khuẩn GS20, GS21 và GS38 cho thấy chỉ có dòng GS38 có khả năng hóa hướng động theo dầu nhớt.. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy và hóa hướng động theo dầu nhớt để làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trong việc xử lý ô nhiễm dầu nhớt trong môi trường đất và nước.. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu nhớt từ đất ô nhiễm. - Qui trình phân lập vi khuẩn có khả năng khoáng hóa dầu nhớt được thực hiện như sau: Cho 5 g mẫu đất vào bình tam giác 100 mL chứa 45 mL môi trường khoáng tối thiểu (MM) lỏng. - pH=7±0,2 và bổ sung 1% (v/v) dầu nhớt (Dầu nhờn xe số, 4T SL10W-30, Honda) như là nguồn carbon duy nhất cho vi khuẩn sử dụng. - Sau một tuần nuôi cấy, chuyển 5 mL dịch huyền phù vi khuẩn sang bình tam giác 100 mL chứa 45 mL môi trường MM mới có bổ sung 1% (v/v) dầu nhớt và mẫu được đặt trên máy lắc tròn với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Hút 10 µL dịch huyền phù vi khuẩn của từng nồng độ pha loãng và trải lên bề mặt môi trường MM đặc (1,5% agar) có bổ sung Tween 80 (1% v/v) và ủ ở 32ºC. - Các dòng vi khuẩn có khả năng tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi được nuôi cấy trên môi trường MM đặc hoặc Peptone có bổ sung Tween 80 là các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Tween 80 và cũng được xem là có khả năng phân hủy dầu nhớt. - Các dòng vi khuẩn thuần được mô tả các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, tế bào và nhuộm Gram sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường Peptone-Tween 80.. - Khảo sát sự tăng trưởng của các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung Tween 80. - Chủng một khuẩn lạc của mỗi dòng vi khuẩn phân lập vào ống nghiệm 12 mL có chứa 4 mL môi trường Tryptone Soya Broth (TSB, 30 g TSB/L).. - Chủng 40 µL dịch huyền phù vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ quang vào ống nghiệm 12 mL chứa 4 mL môi trường MM lỏng có bổ sung Tween 80 (1% v/v). - Hai nghiệm thức đối chứng được thực hiện đồng thời gồm nghiệm thức 1 có chủng vi khuẩn nhưng không bổ sung Tween 80, nghiệm thức 2 có bổ sung Tween 80 nhưng không chủng vi khuẩn. - Sau 3 ngày nuôi cấy, đo mật độ quang (OD 600nm ) và so sánh sự khác nhau về độ đục (sinh khối) của từng dòng vi khuẩn so với hai nghiệm thức. - Các dòng vi khuẩn tạo sinh khối cao (có giá trị mật độ quang cao) khi môi trường nuôi cấy có bổ sung Tween 80 so với môi trường không bổ sung Tween sẽ được tuyển chọn để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.. - Khảo sát khả năng khoáng hóa dầu nhớt của các dòng vi khuẩn phân lập. - Khả năng khoáng hóa dầu nhớt của các dòng vi khuẩn phân lập được xác định thông qua hiệu suất tạo ra khí CO 2 từ quá trình khoáng hóa dầu nhớt và sự phát triển về mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng.. - Chủng một khuẩn lạc của mỗi dòng vi khuẩn thuần (đã được tuyển chọn ở Mục 2.2) vào ống nghiệm 12 mL chứa 4 mL môi trường TSB tiệt trùng. - Sau đó, hút 300 µL huyền phù vi khuẩn đã được điều chỉnh và chủng vào bình tam giác 50 mL chứa 30 mL môi trường MM tiệt trùng có bổ sung 2% (v/v) dầu nhớt. - Hai nghiệm thức đối chứng được thực hiện song song gồm nghiệm thức 1 có chủng vi khuẩn nhưng không bổ sung dầu nhớt và nghiệm thức 2 có bổ sung dầu nhớt nhưng không chủng vi khuẩn. - Hiệu suất sinh khí CO 2 sinh ra từ quá trình phân hủy dầu nhớt của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng theo thời gian thí nghiệm được tính tích lũy và xác định theo công thức sau:. - (1 − Thể tích HCl dùng để chuẩn độ ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn. - Thể tích HCl dùng để chuẩn độ ở nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. - Xác định mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Vào mỗi thời điểm thu mẫu, hút 100 µL môi trường nuôi cấy lỏng của từng dòng vi khuẩn và cho vào eppendorf 2 mL có chứa 900 µL dung dịch phosphate buffered saline (PBS). - Thực hiện dãy nồng độ pha loãng dịch vi khuẩn đến 10 -8 bằng dung dịch PBS (hệ số pha loãng 10). - Hút 10 µL huyền phù vi khuẩn ở từng độ pha loãng và nhỏ 3 giọt (10 µL/giọt) lên 1/3 đĩa petri có chứa môi trường TSA (mỗi đĩa petri được chia làm 3 phần bằng nhau) và mẫu được ủ ở 32°C. - Sau 24 giờ ủ, đếm số khuẩn lạc được hình thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy và tính mật số vi khuẩn theo công thức:. - Mật số vi khuẩn (CFU/mL). - Khảo sát khả năng hóa hướng động theo dầu nhớt của các dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Dựa vào kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng khoáng hóa của các dòng vi khuẩn ở Mục 2.3.1, tuyển chọn các dòng vi khuẩn khoáng hóa dầu nhớt tốt nhất trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Các dòng vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường TSA trong 1 ngày. - Sau đó, chủng một khuẩn lạc của mỗi dòng vi khuẩn vào vào ống nghiệm 12 mL có chứa. - Điều chỉnh mật độ quang (OD 600nm ) của dịch nuôi cấy vi khuẩn về giá trị 0,8. - Sinh khối vi khuẩn được rửa 3 lần bằng dung dịch đệm. - (1) nhỏ dung dịch vi khuẩn quanh giọt agar có bổ sung nhớt. - (2) nhỏ dung dịch đệm quanh giọt agar có bổ sung nhớt và (3) nhỏ dung dịch huyền phù vi khuẩn quanh giọt agar không bổ sung nhớt. - Sự tập trung tế bào vi khuẩn xung quanh giọt agar được quan sát dưới kính hiển vi (phóng đại 100 lần). - Vi khuẩn có khả năng hóa hướng động theo dầu nhớt sẽ tập trung thành vòng trắng đục quanh giọt agar có bổ sung dầu nhớt trong khi ở các nghiệm thức đối chứng không. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu nhớt từ đất ô nhiễm dầu nhớt. - Từ 3 mẫu đất được thu ở hai cửa hàng sửa xe và một xưởng cơ khí thuộc thành phố Cần Thơ, tổng cộng có 43 dòng vi khuẩn tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Tween 80 (1% v/v) đã được phân lập. - Trong đó, 27 dòng là vi khuẩn Gram âm và 16 dòng là vi khuẩn Gram dương. - Về đặc điểm hình thái, 26 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn (60,5%) và 17 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều (39,5. - dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu trắng đục (79. - 8 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong (18,6%) và 1 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng (2,4. - Khuẩn lạc vi khuẩn có dạng bìa nguyên là 21 dòng (48,8. - Về độ nổi, 29 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có độ nổi lài (67,4. - 11 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc phẳng (25,6%) và 3 dòng vi khuẩn có độ nổi mô (7%).. - Trong số 43 dòng vi khuẩn phân lập, 15 dòng được phân lập ở cửa hàng sửa xe 1 (34,8. - Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn đại diện được minh họa ở Hình 2.. - Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn đại diện có khả năng phân hủy dầu nhớt được phân lập trên môi trường Tween-Peptone. - vi khuẩn phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung Tween 80. - Kết quả khảo sát sự tăng trưởng về sinh khối của các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung Tween 80 (1% v/v) cho thấy có sự khác nhau về sinh khối của các dòng vi khuẩn phân lập khi được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung Tween 80 so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung Tween 80. - Tất cả 43 dòng vi khuẩn khảo sát đều tạo sinh khối vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung Tween 80 cao hơn rất nhiều so với môi trường MM không bổ sung Tween 80 (Hình 3). - Trong các dòng vi khuẩn thử nghiệm, ba dòng GS20, GS21 và GS38 có giá trị mật độ quang lần lượt là 1,000. - Mật độ quang của 3 dòng vi khuẩn này trong môi trường MM bổ sung Tween 80 (1%. - v/v) cao hơn so với 40 dòng vi khuẩn thử nghiệm còn lại, tuy nhiên, chỉ có dòng GS38 có giá trị mật độ quang khác biệt ý nghĩa thống kê (p <. - 0,05) so với 40 dòng vi khuẩn này. - Mật độ quang của 3 dòng vi khuẩn GS20, GS21 và GS38 không khác biệt thống kê (p <. - Sự khác nhau về sinh khối của 3 dòng vi khuẩn GS20, GS21 và GS38 trong môi trường MM có và không bổ sung Tween 80 được minh họa ở Hình 4. - Các dòng vi khuẩn có khả năng tạo sinh khối trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Tween 80 chứng tỏ chúng có khả năng phân hủy và sử dụng Tween 80 như nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển trong thời gian thí nghiệm. - Vì vậy, 3 dòng vi khuẩn GS20, GS21 và GS38 được tuyển chọn để tiến hành khảo sát khả năng khoáng hóa dầu nhớt.. - Các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn GS20, GS21 và GS38 được trình bày ở Bảng 1 và minh họa ở Hình 5.. - Giá trị mật độ quang của 43 dòng vi khuẩn phân lập sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung Tween 80 (MMT) và không bổ sung Tween 80 (MM) Các giá trị trung bình theo sau có các mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.. - Hình 4: Sự khác biệt về sinh khối của 3 dòng vi khuẩn tiêu biểu nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có (1) và không (2) bổ sung Tween 80. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn tạo sinh khối cao trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Tween 80. - Hình thái khuẩn lạc và tế bào (phóng đại 1000 lần) của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường Tween-Peptone. - dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Ba dòng vi khuẩn được tuyển chọn gồm GS20, GS21 và GS38 được nuôi cấy trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung dầu nhớt (2% v/v) như là nguồn cung cấp carbon duy nhất. - Kết quả khảo sát khả năng khoáng hóa dầu nhớt thông qua chỉ tiêu CO 2 phóng thích ra từ môi trường nuôi cấy của 3 dòng vi khuẩn sau 4 ngày được trình hày trong Hình 6. - Nhìn chung, lượng CO 2 sinh ra thông qua quá trình khoáng hóa dầu nhớt của cả 3 dòng vi khuẩn có xu hướng tăng trong thời gian thí nghiệm.. - Điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu nhớt như là nguồn carbon cho sự sinh trưởng và phát triển. - Ở mỗi thời điểm thu mẫu, các nghiệm thức được chủng vi khuẩn có lượng CO 2 sinh ra khác biệt có ý nghĩa thông kê (p <. - Dòng vi khuẩn GS20. - 0,05) so với nghiệm thức có chủng dòng vi khuẩn GS21 và GS38 với hiệu suất CO 2 tích lũy lần lượt là 72,9%. - Lượng CO 2 tích lũy sinh ra từ sự khoáng hóa dầu nhớt trong môi trường MM lỏng có bổ sung dầu nhớt (2% v/v) của 3 dòng vi khuẩn sau 4 ngày nuôi cấy. - Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng theo thời gian bố trí thí nghiệm được trình bày trong Hình 7. - Trong số 3 dòng vi khuẩn thử nghiệm, dòng GS38 có mật số vi khuẩn cao nhất, đạt 4,5×10 8 CFU/mL. - Sau thời gian này, mật số vi khuẩn giảm mạnh. - Mật số vi khuẩn trong môi trường MM lỏng bổ sung dầu nhớt (2% v/v) sau 4 ngày nuôi cấy. - Khả năng hóa hướng động của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn theo dầu nhớt. - Kết quả khảo sát khả năng hóa hướng động của 3 dòng vi khuẩn GS20, GS21 và GS38 (Hình 8) cho thấy chỉ có dòng vi khuẩn GS38 thể hiện có khả năng hóa hướng động theo dầu nhớt. - nhớt (Hình 8.C), vi khuẩn tập trung tạo thành vòng trắng đục quanh giọt agar. - Khả năng hóa hướng động theo dầu nhớt của dòng vi khuẩn GS38 khi quan sát dưới kính hiển vi (phóng đại 100 lần). - B: đối chứng (giọt agar không bổ sung dầu nhớt + vi khuẩn). - C: giọt agar có bổ sung dầu nhớt + huyền phù vi khuẩn. - Hóa hướng động theo một hợp chất hữu cơ là đặc điểm thuận lợi của vi khuẩn trong quá trình sống. - Ngoài ra, vi khuẩn Novosphingobium sp.. - Bên cạnh đó, dòng vi khuẩn Pseudomonas putida G7 có khả năng phân hủy phenanthrene cũng được chứng minh là có đặc tính hóa hướng động theo hợp chất hydrocarbon đa vòng thơm này (Grimm and Harwood, 1997). - Trong nghiên cứu này, dòng vi khuẩn GS38 đã được chứng minh có khả năng khoáng hóa và hóa hướng động theo dầu nhớt. - Từ 3 mẫu đất nhiễm dầu nhớt thu được tại 3 phường An Hội, Xuân Khánh và Tân An thuộc thành phố Cần Thơ, 43 dòng vi khuẩn khác nhau đã. - Trong 43 dòng vi khuẩn phân lập, 27 dòng là vi khuẩn Gram âm và 16 dòng là vi khuẩn Gram dương. - Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh trưởng trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung Tween 80 (1% v/v), trong đó 3 dòng vi khuẩn ký hiệu GS20, GS21 và GS38 thể hiện khà năng phát triển sinh khối cao nhất. - Sau 4 ngày nuôi cấy trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung dầu nhớt, cả 3 dòng vi khuẩn này đều tăng sinh khối và sinh CO 2 cao, trong đó dòng GS20 có khả năng sinh CO 2 cao nhất với lượng CO 2 tích lũy đạt 93,4% sau 3 ngày nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate kali từ đất trồng nhãn ở quận Thốt Nốt, Cần Thơ