Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng đối kháng in vitro với nấm Fusarium solani và Colletotrichum gloeosporioides

- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Pseudomonas CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG in vitro VỚI NẤM Fusarium solani VÀ Colletotrichum gloeosporioides Trương Chí Hiền 1 và Lê Thanh Toàn 2*.
- Sacc., Fusarium solani (Mart.) Sacc., khả năng đối kháng, Pseudomonas, vi khuẩn kích thích cây trồng tăng trưởng.
- Kết quả phân lập và làm thuần được 56 dòng vi khuẩn Pseudomonas..
- Trong 56 dòng Pseudomonas thuần, chín dòng VLND-0101, VLND-0301, VLND-0901, VLND-0501, VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501, CTND-0104, CTND-0902 đối kháng mạnh với Fusarium, với hiệu suất đối kháng dao động từ .
- Tiếp theo, trong chín dòng vi khuẩn Pseudomonas, bốn dòng vi khuẩn VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501, CTND-0902 có khả năng đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum, với hiệu suất đối kháng dao động từ .
- Trong bốn dòng vi khuẩn Pseudomonas này, chiều dài rễ và chồi cây đậu xanh sau khi xử lý với dòng CTND-0501 là cao nhất, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.
- Bên cạnh đó, tổng số rễ phụ cây đậu xanh, khối lượng tươi của rễ và chồi ở 5 ngày sau xử lí của dòng CTND-0501 khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức xử lý còn lại.
- Kết quả định danh cho thấy dòng CTND- 0501 là loài Pseudomonas mosselii..
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng đối kháng in vitro với nấm Fusarium solani và Colletotrichum gloeosporioides.
- Phòng trừ bệnh cho cây bằng việc sử dụng vi khuẩn đối kháng với nấm bệnh là biện pháp sinh học đang được quan tâm nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh do nấm và giảm được lượng thuốc hóa học.
- Vi khuẩn vùng rễ là những vi khuẩn sống ở khu vực xung quanh vùng rễ, có khả năng sống và phát triển tốt với mật số khá phong phú xung quanh vùng rễ.
- Sự hiện diện của vi khuẩn vùng rễ có thể có tác động trung tính, có hại hoặc có lợi đối với sự phát triển của cây trồng (Antoun and Prévost, 2005).
- Khoảng 2 - 5% vi khuẩn vùng rễ khi chủng vào đất có vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện có lợi cho sự tăng trưởng của cây trồng được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR) (Kloepper and Schroth, 1978).
- (2019) nhận định rằng PGPR là các vi khuẩn sống tự do trong đất mà nó có thể mang đến nhiều ảnh hưởng có lợi cho cây trồng thông qua việc nâng cao sự nảy mầm của hạt, sự phát triển của rễ, sự hấp thu nước và dinh dưỡng khoáng và đóng vai trò quan trọng trong phòng trừ các tác nhân gây bệnh trên cây trồng.
- Vì vậy, nghiên cứu đã được thực hiện với mục đích phân lập và tìm ra các dòng vi khuẩn Pseudomonas đối kháng với nấm bệnh Fusarium solani (Mart.) Sacc.
- 2.1 Thu mẫu đất, phân lập và xác định vi khuẩn Pseudomonas.
- Vi khuẩn Pseudomonas được xác định thông qua đặc điểm khuẩn lạc, các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ được cấy truyền sang môi trường King’s B mới..
- 2.2 Đánh giá khả năng đối kháng in vitro của các dòng Pseudomonas đối với nấm F..
- Mỗi nghiệm thức là một dòng vi khuẩn Pseudomonas.
- Khoanh giấy thấm thanh trùng đã được nhúng vào huyền phù vi khuẩn Pseudomonas hoặc nước cất thanh trùng.
- Bán kính khuẩn lạc nấm về phía vi khuẩn và bán kính khuẩn lạc nấm về phía đối chứng được đo ở các thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau bố trí (NSBT), và xác định hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức HSĐK.
- 100%, trong đó BKKLvk là bán kính khuẩn lạc nấm về phía vi khuẩn (mm), BKKLđc là bán kính khuẩn lạc nấm về phía đối chứng (mm)..
- Các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh được chọn để tiếp tục bố trí cho thí nghiệm tiếp theo..
- 2.3 Đánh giá khả năng đối kháng in vitro của các dòng vi khuẩn Pseudomonas được tuyển chọn đối với nấm C.
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN một nhân tố, số nghiệm thức là số chủng vi khuẩn có HSĐK cao được chọn từ thí nghiệm trước, 4 lặp lại..
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và chọn ra các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh để thực hiện thí nghiệm tiếp theo..
- 2.4 Đánh giá hiệu quả kích thích sinh trưởng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas có triển vọng đối với đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm.
- Thí nghiệm được bố trí HTNN một nhân tố, mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức và đối chứng nước cất, 3 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 10 hạt.
- Nguồn vi khuẩn Pseudomonas được nuôi 7 ngày trong môi trường King’s B.
- Hạt đậu xanh được ngâm trong huyền phù vi khuẩn với mật số là 10 8 cfu/mL trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng..
- Sau đó, hạt đậu được ủ trong đĩa petri có lót giấy thấm bổ sung 5 mL huyền phù vi khuẩn cho giấy đủ ướt, ở nhiệt độ phòng.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và chọn ra một dòng vi khuẩn hiệu quả nhất để xác định tên loài..
- 2.5 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR Một dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng tốt nhất được chọn để gởi mẫu định danh ở công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ..
- 3.1 Kết quả thu mẫu đất, phân lập và xác định vi khuẩn Pseudomonas.
- Kết quả đã phân lập, làm thuần được 56 dòng vi khuẩn Pseudomonas..
- 3.2 Khả năng đối kháng in vitro của các dòng Pseudomonas đối với nấm F.
- Trong 56 dòng vi khuẩn Pseudomonas đã phân lập, chỉ có 33 dòng vi khuẩn thể hiện đối kháng, 23.
- dòng còn lại không có khả năng đối kháng với nấm F.
- Trong 33 dòng vi khuẩn đối kháng, Bảng 1 cho thấy ở thời điểm 3 NSBT, 2 dòng VLND- 0901, CTND-0501 có hiệu suất đối kháng lần lượt là 54,80 và 54,88%, cao hơn và khác biệt không có ý nghĩa so với các dòng VLND-0501, CTND-0301 nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại.
- Sang thời điểm 5 NSBT, hiệu suất đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas khác biệt ở mức ý nghĩa 1%.
- Trong đó, dòng CTND-0501 có hiệu suất đối kháng là 65,76%, cao hơn và khác biệt không có ý nghĩa so với các dòng VLND-0101, VLND-1203, CTND-0301, CTND-0902, nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại trong thí nghiệm.
- Ở thời điểm 7 NSBT, hiệu suất đối kháng của dòng CTND-0501 là cao nhất (60,00%) và có khác biệt không ý nghĩa so với các dòng VLND-0501, VLND-1203, CTND-0301, CTND-0104, CTND-0902 nhưng khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại.
- Dòng CTND-0501 có hiệu suất đối kháng cao và khác biệt so với các dòng còn lại ở hầu hết các thời điểm khảo sát, đặc biệt là duy trì hiệu suất khả năng đối kháng cao đến thời điểm 7 NSBT (Bảng 1)..
- Tác giả cho biết vi khuẩn Pseudomonas putida có thể ngăn chặn sự phát triển của F.
- (2017) cho biết vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dòng BRp3 được phân lập từ vùng rễ có khả năng đối kháng nhiều mầm bệnh khác nhau trên cây lúa..
- Hình 1: Khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn Pseudomonas CTND-0501 đối với nấm F.
- Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của 33 dòng Pseudomonas với nấm F.
- solani cho thấy dòng vi khuẩn CTND-0501 có biểu hiện đối kháng vượt trội hơn so với các dòng còn lại.
- Dòng CTND-0501 biểu hiện khả năng đối kháng sớm và duy trì hơn so với các dòng còn lại.
- dòng VLND-0101, VLND-0301, VLND-0901, VLND-0501, VLND-1203, CTND-0301, CTND- 0104, CTND-0902 cũng có hiệu suất đối kháng tương đối cao (Hình 1).
- Chín dòng vi khuẩn này được sử dụng để thực hiện thí nghiệm tiếp theo..
- Bảng 1: Hiệu suất đối kháng.
- Vi khuẩn Thời điểm khảo sát.
- Số liệu đã được chuyển sang arcsin√ 𝑥 khi phân tích thống kê 3.3 Khả năng đối kháng in vitro của chín.
- dòng vi khuẩn Pseudomonas được tuyển chọn đối với nấm C.
- Bảng 2 cho thấy ở 3 NSBT, dòng CTND-0902 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm.
- Colletotrichum vượt trội nhất, thể hiện qua hiệu suất đối kháng là 54,34%, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại.
- Tiếp theo là 3 dòng CTND-0301, CTND-0501, VLND-0101 có khả năng đối kháng cao hơn 40% tương ứng là 43,31;.
- Đến thời điểm 5 NSBT, tất cả các dòng vi khuẩn đều duy trì hiệu suất đối kháng trên 30%.
- Trong đó, dòng CTND-0501 có hiệu suất đối kháng cao nhất (56,41%) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại.
- Hai dòng CTND-0902, VLND-0101 lần lượt có hiệu suất đối kháng từ 54,34%.
- Dòng CTND- 0104 có khả năng đối kháng thấp nhất (33,78%) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại (Bảng 2)..
- Ở thời điểm 7 NSBT, bốn dòng VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501, CTND-0902 đều duy trì khả năng đối kháng nấm so với thời điểm 3 và 5 NSBT.
- Trong đó, dòng CTND-0501 có hiệu suất đối kháng cao nhất là 61,77% và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại.
- Ở chỉ tiêu trung bình HSĐK qua ba thời điểm khảo sát, hai dòng CTND-0501 và CTND-0902 biểu hiện khả năng đối kháng vượt trội so với các dòng còn lại, lần lượt 53,65% và 51,85%..
- Đặc biệt dòng CTND-0501 có hiệu suất đối kháng cao nhất và duy trì liên tục đến thời điểm 7 NSBT (Bảng 2, Hình 2)..
- Bảng 2: Hiệu suất đối kháng.
- của 9 dòng vi khuẩn Pseudomonas với nấm C.
- Số liệu đã được chuyển sang arcsin√ 𝑥 khi phân tích thống kê Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng.
- gloeosporioides cho thấy dòng CTND-0501 có biểu hiện đối kháng vượt trội hơn so với các dòng còn lại về HSĐK.
- Khả năng ức chế sự phát triển của nấm của dòng CTND-0105 biểu hiện sớm và duy trì đến ngày thứ 7 sau bố trí.
- Tiếp theo là các dòng CTND- 0902, VLND-1203, CTND-0301 có khả năng đối kháng tương đối cao.
- fluorescens có khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm C.
- (2016) đã báo cáo khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn vùng rễ vối nấm Colletotrichum sp.
- Bốn dòng vi khuẩn CTND-0105, CTND-0902, VLND-1203, CTND-0301 được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo trên hạt đậu xanh..
- Hình 2: Khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn Pseudomonas CTND-0501 đối với nấm C..
- 3.4 Hiệu quả kích thích sinh trưởng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas có triển vọng đối với đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm.
- Chiều dài rễ đậu xanh ở thời điểm 3 và 5 NSXL khi được xử lý trong huyền phù vi khuẩn CTND- 0501 là cao nhất (lần lượt là 71,03 mm.
- Hình 3: Khả năng kích thích sinh trưởng đậu xanh của các dòng Pseudomonas triển vọng ở 5.
- Tổng khối lượng tươi của rễ và chồi đậu xanh được xử lý với huyền phù CTND-0501 cao nhất, đạt lần lượt là 0,51 và 2,78 g, khác biệt có ý nghĩa thống.
- Kế đến là nghiệm thức xử lý với huyền phù CTND-0501 có khối lượng tươi của rễ khoảng 0,61 g, của chồi khoảng 3,20 g, đều cao hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.
- Số lượng rễ phụ của đậu xanh khi được ngâm bởi CTND-0501 ở thời điểm 5 NSXL là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại..
- CTND-0501 0,61 a 3,20 a 20,00 a.
- Bốn dòng vi khuẩn VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501 và CTND-0902 đều có khả năng kích.
- Trong đó, dòng vi khuẩn CTND-0501 có biểu hiện tốt nhất ở cả hai thời điểm 3 và 5 NSXL.
- 3.5 Kết quả định danh dòng Pseudomonas CTND-0501 bằng phương pháp sinh học phân tử.
- Dòng vi khuẩn Pseudomonas có hiệu suất đối kháng mạnh (CTND-0501) được tiến hành ly trích DNA, khuếch đại vùng gene 16S rDNA, bằng cặp mồi 03F và 03R của công ty Sinh hóa Phù Sa.
- Kết quả so sánh trình tự DNA của vi khuẩn trên NCBI bằng công cụ tìm kiếm BLAST cho thấy mẫu dòng vi khuẩn CTND-0501 là loài Pseudomonas mosselii với mức độ tương đồng loài là 99,79% (Hình 4)..
- Hình 4: Kết quả so sánh mức độ tương đồng của dòng Pseudomonas CTND-0501 với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI.
- Loài vi khuẩn này có khả năng giúp tăng khả năng sản sinh indole-3-acetic-acid, giúp hòa tan lân khó tan trong đất, tăng hoạt tính enzyme nitrogenase ở cây dứa sợi (Agave americana L.) (Torre-Ruiz et al., 2016), cũng như là tác nhân phòng trừ sinh học bệnh cháy lá ở cây lúa (Wu et al., 2018)..
- Ttrong đó, 9 dòng Pseudomonas là VLND-0101, VLND- 0301, VLND-0901, VLND-0501, VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501, CTND-0104, CTND- 0902 có khả năng đối kháng cao với nấm F.
- Trong đó, bốn dòng Pseudomonas VLND-1203, CTND-0301, CTND-0501, CTND-0902 đều có khả năng đối kháng với nấm C.
- gloeosporioides, với dòng CTND-0501 có khả năng đối kháng cao nhất..
- Bốn 4 dòng VLND-1203, CTND-0301, CTND- 0501, CTND-0902 đều có khả năng kích thích sinh trưởng và duy trì so với đối chứng, với dòng CTND- 0501 có biểu hiện tốt nhất.
- Kết quả định danh của dòng Pseudomonas CTND-0501 là loài Pseudomonas mosselii..
- Các cơ chế phòng trừ sinh học và hiệu quả phòng trừ bệnh ở nhà lưới của dòng vi khuẩn Pseudomonas mosselii sẽ được thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo..
- Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân lên sinh trưởng và năng suất lúa IR 50404 tại xã Hiếu Nhơn, huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long.
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp.
- Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus đối với nấm Fusarium moniloforme gây bệnh lúa von tại đồng bằng sông Cửu Long.
- Phân lập và tuyển chọn những chủng xạ khuẩn triển vọng đối kháng với tuyến trùng Pratylenchus sp