- DOI:10.22144/jvn.2016.581 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TỪ ĐẤT VÙNG RỄ ỚT CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Colletotrichum SP. - Colletotrichum sp., đặc tính đối kháng, định danh, ớt, vi khuẩn đối kháng, vùng gen 16S-rDNA. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp. - Từ 18 mẫu đất vùng rễ ớt được thu tại Cần Thơ, Đồng Tháp, Tiền Giang có 341 dòng vi khuẩn được thử sơ bộ khả năng đối kháng, kết quả tuyển chọn và phân lập được 79 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng. - Hiệu suất đối kháng của các dòng vi khuẩn dao động từ . - Khảo sát các đặc tính đối kháng của vi khuẩn cho thấy có 47 dòng có khả năng sản sinh siderophore, 61 dòng có khả năng phân hủy chitin, 55 dòng có khả năng phân hủy cellulose và 68 dòng có khả năng phân hủy protein. - Chọn lọc 6 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh nhất gồm: CT6, CT10, CT15, CT17, CT21, TG36 để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa để phân loại theo hệ thống phân loại Bergey đã xác định được cả 6 dòng này đều thuộc chi Bacillus. - Dòng vi khuẩn CT10 có khả năng đối kháng mạnh nhất được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử thông qua giải trình tự vùng gene 16S rDNA kết hợp với phương pháp truyền thống. - Kết quả cho thấy dòng vi khuẩn CT10 được xác định là vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp. - Dựa trên sự tương tác giữa các vi sinh vật trong hệ sinh thái nhằm phát huy vai trò của các vi sinh vật có ích nhờ khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh mà đề tài đặt ra mục tiêu của nghiên cứu là nhằm phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt tại một số địa điểm ở Cần Thơ, Đồng Tháp, Tiền Giang có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp.. - 2.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp. - Phương pháp thu thập mẫu đất và phân lập vi khuẩn đối kháng dựa theo nghiên cứu của Abdulkadir và Waliyu (2012).. - 2.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng. - Sau 2 ngày, tiến hành cấy vi khuẩn lên bề mặt đĩa nấm đã ủ.. - (I: hiệu suất đối kháng của vi khuẩn. - r: bán kính của hệ sợi nấm trên đĩa có chủng vi khuẩn (cm)).. - Các dòng vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường CAS-blue agar. - Sau thời gian 3 ngày tiến hành đo đường kính vòng halo màu vàng xung quanh khuẩn lạc để đánh giá khả năng sản sinh siderophore của vi khuẩn. - Xác định khả năng phân giải chitin của vi khuẩn bằng cách nhuộm với dung dịch Lugol. - Vi khuẩn phân giải chitin sẽ tạo vòng halo không bắt màu xung quanh khuẩn lạc, đo đường kính vòng halo để xác định khả năng phân hủy chitin trong môi trường. - Xác định khả năng phân hủy protein: Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường sữa (Priest et al., 1993). - Xác định khả năng phân giải protein của vi khuẩn bằng cách dùng thước đo đường kính vòng halo phân giải. - 2.2.4 Định danh vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey. - Chọn 6 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum sp. - để định danh bằng phương pháp truyền thống thông qua các thử nghiệm sau: Xác định đặc điểm của các dòng vi khuẩn dựa vào đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram, nhuộm bào tử. - Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR: Chọn một dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh nhất để định danh bằng phương pháp hiện đại.. - Ly trích DNA của vi khuẩn: Dựa theo quy trình chuẩn của Maniatis et al. - Định danh các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR:. - Giải trình tự DNA để định danh dòng vi khuẩn:. - Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự vùng gen 16S rDNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information).. - 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp.. - Từ 18 mẫu đất vùng rễ ớt được thu thập tại ba tỉnh là Cần Thơ, Đồng Tháp và Tiền Giang, tiến hành nhận diện sơ bộ khả năng đối kháng của 341 dòng vi khuẩn trên đĩa thạch, dựa trên khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm Colletotrichum sp. - xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn để chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng. - Từ kết quả trên cũng cho thấy tỷ lệ số dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng là rất thấp (79/341 dòng). - Vì vậy, việc thử đối kháng sơ bộ trước khi tiến hành phân lập để loại bỏ những dòng vi khuẩn không có khả năng đối kháng là rất cần thiết, giúp tiết kiệm rất nhiều về thời gian và chi phí.. - Trong số 79 dòng vi khuẩn phân lập được, đa số khuẩn lạc có màu trắng đục (chiếm 54,4. - Tuy nhiên, trong quá trình cấy trữ lâu ngày, khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn có hiện tượng chuyển từ màu trắng đục sang màu nâu nhạt. - Đường kính khuẩn lạc: Phần lớn các dòng vi khuẩn đã phân lập được có đường kính khuẩn lạc dao động từ 2-4mm sau khi cấy trên môi trường đặc trong 48 giờ.. - Hình 1: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp 3.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng. - Hiệu suất đối kháng của 79 dòng vi khuẩn đối với nấm Colletotrichum sp. - sau 5 ngày chủng vi khuẩn nhìn chung tăng dần, lúc đầu tăng nhanh về sau chậm lại. - Kể từ ngày thứ 6 trở đi hiệu suất đối kháng của một số dòng vi khuẩn giảm xuống, điều. - của các dòng vi khuẩn phân lập được. - Số dòng vi khuẩn . - Theo kết quả được trình bày ở Bảng 1, phần lớn các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng từ 30 đến 49. - Số dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng đạt trên 50% chỉ có 4 dòng. - Trong số 79 dòng vi khuẩn được khảo sát, có 2 dòng vi khuẩn là CT6 và CT10 cho kết quả cao nhất và có thể ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum sp lần lượt là 53,34% và 53,33%. - Dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng yếu nhất là ĐT1 chỉ có thể ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm là 7,78%.. - Bảng 2: Khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn. - Khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn được thể hiện trong Bảng 2. - Có 47 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore trong số 79 dòng vi khuẩn khảo sát trên môi trường CAS-. - Có 32 dòng vi khuẩn còn lại không làm đổi màu môi trường thuốc thử CAS- blue chiếm 40,5%. - Phần lớn các dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore vào khoảng từ 0,5. - Ba dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore lớn nhất là TG3, TG4, TG8 (1,9 cm, 1,5 cm và 1,47 cm). - Dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore nhỏ nhất là TG26 (0,2 cm) và cho kết quả khác biệt có ý nghĩa với các dòng vi khuẩn còn lại với độ tin cậy 95%.. - 3.3.2 Khả năng phân hủy chitin. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy chitin của các dòng vi khuẩn được thể hiện ở Bảng 3.. - Trong 79 dòng vi khuẩn được khảo sát, có 61 dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân hủy chitin (chiếm 77,21%). - Khả năng phân hủy chitin của các dòng vi khuẩn dao động trong khoảng cm). - Hai dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chitin mạnh nhất là CT13 (3,1 cm) và CT9 (2,63 cm), dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chitin yếu nhất là CT18 (0,17 cm). - Enzyme chitinase tiết ra từ các vi khuẩn đối kháng được đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào nấm bệnh.. - Bảng 3: Khả năng phân hủy chitin của các dòng vi khuẩn phân lập được. - Kết quả khả năng phân hủy cellulose của các dòng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 4.. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy cellulose của các dòng vi khuẩn được trình bày trong Bảng 4 cho thấy, trong 79 dòng vi khuẩn khảo sát có 55 dòng vi khuẩn (chiếm 69,62%) thể hiện khả năng phân hủy cellulose thông qua vòng thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trường CMC. - agar khi nhuộm với Congo Red, có 24 dòng vi khuẩn (chiếm 39,38%) không thể hiện khả năng này, đường kính vòng tròn phân hủy từ cm, trong đó, có bốn dòng vi khuẩn thể hiện rất tốt khả năng này là CT6 (3,23 cm), CT22 (3,07 cm), CT23 (3,0 cm), CT21 (3,0 cm) và cũng là những dòng vi khuẩn cho vòng sáng rõ nhất, các dòng còn lại có xuất hiện vòng sáng nhưng mờ hơn. - Dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose yếu nhất là TG7 (0,37 cm).. - Bảng 4: Khả năng phân hủy cellulose của các dòng vi khuẩn. - 3.3.4 Khả năng phân hủy protein. - Khả năng phân hủy. - protein của các dòng vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường sữa (Priest et al., 1993).. - Bảng 5: Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn. - Khả năng phân hủy protein ở vi khuẩn là một trong những cơ sở để xác định khả năng đối kháng nấm. - Từ kết quả của Bảng 5 cho thấy có 68 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme protease trong số 79 dòng vi khuẩn được khảo sát trên môi trường SMA. - Kết quả đo đường kính vòng tròn phân hủy protein của các dòng vi khuẩn trên dao động từ cm), với dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein trung bình cao nhất là CT23 (1,97 cm) và CT20 (1,93 cm) và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng vi khuẩn còn lại. - Đa số các dòng vi khuẩn thể hiện sự phân hủy protein với giá trị từ cm).. - Từ kết quả khảo sát các đặc tính đối kháng của các dòng vi khuẩn trên có thể thấy, đa số các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng đều có đầy đủ cả 4 đặc tính đối kháng (49,37%) (khả năng sản sinh siderophore. - Có 6,33% số dòng vi khuẩn chỉ có 1 trong 4 đặc tính đối kháng. - Các dòng vi khuẩn không có cả 4 đặc tính đối kháng chiếm 7,59%, tuy nhiên, hiệu suất đối kháng của những dòng vi khuẩn này không cao, chỉ từ 25. - Như vậy, những dòng vi khuẩn không có cả 4 đặc tính đối kháng này có thể đã kháng lại nấm bệnh theo một cơ chế khác.. - Bảng 6: Số đặc tính đối kháng của các dòng vi khuẩn. - khả năng phân hủy chitin, protein và cellulose Những dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng. - các đặc tính đối kháng trong cùng một dòng vi khuẩn có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng đối kháng của chúng.. - Bảng 7: Tổng hợp đặc tính đối kháng của 6 dòng vi khuẩn đối kháng mạnh Dòng vi. - Khả năng phân hủy Chitin (cm). - Khả năng phân hủy Protein (cm). - Khả năng phân hủy Cellulose (cm). - Định danh vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống. - Chọn 6 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng. - Bảng 8: Đặc điểm các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh. - 6 dòng vi khuẩn trên đều thuộc chi Bacillus. - Dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng mạnh (CT10) được tiến hành ly trích DNA, khuếch đại vùng gene 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 8F và 1492R, sau đó sản phẩm PCR của dòng vi khuẩn CT10 được gửi đi giải trình tự tại Singapore.. - Hình 2: Kết quả so sánh mức độ tương đồng của dòng CT10 với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI. - Kết quả so sánh trình tự vùng gen 16S rDNA của dòng CT10 với các trình tự trên cơ sở dữ liệu của NCBI cho thấy dòng vi khuẩn CT10 được xác định có độ tương đồng ở mức 99% với trình tự DNA của các vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (Accession:. - Đề tài đã phân lập được 79 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp.. - Các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm bệnh phân lập được có hiệu suất đối kháng dao động từ 7,78-53,34. - Định danh bằng phương pháp truyền thống các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum sp. - Kết hợp định danh bằng phương pháp truyền thống và hiện đại đã xác định được dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp.. - mạnh nhất cho kết quả: dòng CT10 là vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.. - Cải thiện quy trình nhận diện các dòng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv