- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE TỪ CÁ ĐIÊU HỒNG (OREOCHROMIS SP.) BỆNH PHÙ MẮT VÀ XUẤT HUYẾT. - Mẫu cá điêu hồng bệnh phù mắt và xuất huyết được thu từ những bè nuôi cá điêu hồng thâm canh ở Tiền Giang. - Quan sát bằng kính hiển vi tiêu bản nhuộm Gram mẫu phết máu và thận của cá bệnh thấy có vi khuẩn hình cầu, Gram dương. - Vi khuẩn phân lập từ não và thận trước của cá mọc trên môi trường brain heart agar cũng là vi khuẩn Gram dương, không di động, oxidase âm tính. - Vi khuẩn được định danh là Streptococus agalactiae týp 2 bằng phương pháp sinh hóa, kit API 20 strep và phương pháp ngưng kết miễn dịch. - Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh với dấu hiệu bệnh lý giống như khi thu mẫu với giá trị LD 50 khoảng 4,89 x 10 4 CFU/ml. - agalactiae týp 2 trên cá điêu hồng nuôi ở Việt Nam.. - Từ khóa: Cá điêu hồng, Streptococcus agalactiae, độc lực 1 GIỚI THIỆU. - Cá điêu hồng (Oreochromis sp) là một trong những đối tượng thủy sản đang được nuôi phổ biến ở nước ta, là đối tượng dễ nuôi, có chất lượng thịt ngon và giá trị dinh dưỡng cao nên được nhiều người ưa chuộng. - Cá điêu hồng hiện nay được nuôi chủ yếu trong bè với mật độ thả nuôi rất cao và số lượng bè nuôi ngày một tăng. - hóa nghề nuôi cá điêu hồng cũng không thể tránh khỏi tình trạng dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và gây thiệt hại ngày càng nghiêm trọng. - Bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng trong mô hình nuôi cá điêu hồng thâm canh là bệnh do nhóm vi khuẩn thuộc giống Streptococcus. - Dấu hiệu bệnh lý thường gặp ở cá điêu hồng nhiễm vi khuẩn Streptococcus thường là phù mắt hay lồi mắt, xuất huyết trên thân. - Thời gian gần đây bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các vùng nuôi cá điêu hồng trên bè thuộc các tỉnh Vĩnh Long và Tiền Giang. - Streptococcus là vi khuẩn hình cầu, Gram âm, rất đa dạng về thành phần loài và kiểu huyết thanh nên dễ nhầm lẫn với những nhóm cầu khuẩn khác về kiểu hình và đặc tính sinh lý, sinh hóa. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh hóa, kiểu huyết thanh và khả năng gây bệnh của vi khuẩn S. - agalactiae týp 2 ở cá điêu hồng nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị hiệu quả bệnh vi khuẩn ở đối tượng nuôi thủy sản này.. - 2.1 Phương pháp thu và phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm. - Hai mươi mẫu cá điêu hồng bệnh được thu từ các bè nuôi cá điêu hồng thâm canh ở huyện Cai Lậy, Tiền Giang. - Mẫu cá sau khi được vớt khỏi mặt nước thì tiến hành phân tích ngay và chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới được sử dụng để phân lập vi khuẩn. - Não cá cũng được phân lập vi khuẩn. - Các chủng vi khuẩn phân lập được trữ ở -80°C trong môi trường Brain heart infusion broth (BHIB, Merck) có 25% glycerol. - Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.. - 2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn. - Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh vi khuẩn được trình bày ở bảng 2. - Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. - Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước cất lên lam, trải đều lên lam một ít vi khuẩn, đậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X. - Bảng 1: Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng chọn nghiên cứu. - STT Mã PTN Nơi thu mẫu Cơ quan phân lập Năm thu mẫu 1 ĐH 1 Não Cai lậy, Tiền Giang Não 2010. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng từ 3-5 khuẩn lạc cho vào 3ml nước muối sinh lý, lắc đều rồi nhỏ một giọt dung dịch vi khuẩn lên một lam.. - 2.4 Gây cảm nhiễm. - và (3-9) tiêm vi khuẩn lần lượt với mật độ từ CFU/ml.. - Chủng vi khuẩn ĐH1Não được chọn ngẫu nhiên trong số các chủng phân lập để gây cảm nhiễm. - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường BHIB 24 giờ ở 30C. - Sau đó ly tâm vi khuẩn 7500vòng/phút trong 10 phút, rửa vi khuẩn 2 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,85% và xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường BHIA (CFU/ml). - Cá được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở phần gốc vi ngực, theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong 14 ngày. - Những con cá lờ đờ được thu để quan sát dấu hiệu bệnh lý, làm tiêu bản kính phết thận và tái phân lập và tái định danh vi khuẩn từ thận và não. - Mẫu mô gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm và cá khỏe (đối chứng) được lấy để xác định đặc điểm mô bệnh học theo phương pháp của Coolidge và Howard (1979). - Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD 50 ) được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938): LD50 = 10a-p.d (p.d = (L%-50/L%-H. - a: số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất nhưng trên 50%. - 3 KẾT QUẢ. - Xét nghiệm kính phết mẫu máu và thận của cá bệnh bằng cách soi tươi nhuộm Gram và nhuộm Giêmsa đều thấy rất nhiều vi khuẩn dạng hình cầu nằm rải rác trên vùng mô phết kính hoặc tập trung thành từng cụm. - Ở một số mẫu thận cá bệnh, vi khuẩn xâm nhập, phá hủy tế bào làm tế bào bị vỡ. - Các mẫu ở thận cũng cho thấy đại thực bào vi khuẩn (Hình 2A và 2B).. - Hình 2: Vi khuẩn trong thận của cá điêu hồng bệnh thu từ bè nuôi. - (B) Vi khuẩn tấn công vào hồng cầu (nhuộm Giêm. - 3.2 Phân lập, định danh và định týp vi khuẩn. - Kết quả phân lập được 9 chủng vi khuẩn từ gan, thận và não (Bảng 1). - Trên môi trường BHIA sau 48 giờ ở 30 o C vi khuẩn phát triển chậm thành các khuẩn lạc có hình tròn, lồi, màu kem, kích thước từ thước khoảng 1mm (Hình 3A). - Vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa 5% máu cừu nhưng không có khả năng gây tan huyết.. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng bệnh. - Chủng vi khuẩn. - Kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng bệnh xuất huyết được trình bày ở Bảng 2.. - Chúng là vi khuẩn Gram dương, hình cầu hay liên cầu, không di động, phản ứng âm tính với oxidasevà catalase, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí. - Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng kit API 20 Strep (Bảng 2) cho thấy tất cả 9 các chủng vi khuẩn cho phản ứng âm tính với Esculin và Pyrrolidonyl Arylamidase, dương tính với Voges Proskauer, có khả năng thủy phân hippuric acid, không có khả năng acid hóa hầu hết tất cả các loại. - Tuy nhiên, có 3/9 chủng vi khuẩn cho phản ứng Arginine Dihydrolase dương tính. - Dựa trên các chỉ tiêu sinh hóa và căn cứ vào mã số định danh của kit API 20 Strep, tất cả 9 chủng vi khuẩn được định danh là Streptococcus agalactiae.. - Kết quả này tương tự như kết quả của Buller (2004) khi định danh vi khuẩn S.. - Trong nghiên cứu này, phản ứng ngưng kết miễn dịch giúp phát hiện nhanh và nhận dạng kiểu huyết thanh (serotýp) Ib hay kiểu sinh học (biotype) 2 của vi khuẩn S. - Kết quả cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn cho kết quả dương tính giúp xác định các chủng vi khuẩn phân lập được là S. - (phải) Kết quả ngưng kết miễn dịch. - 3.3 Khả năng gây bệnh xuất huyết ở cá điêu hồng của vi khuẩn phân lập Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm chủng ĐH1não ở những nồng độ khác nhau thì tỉ lệ chết và thời gian xuất hiện bệnh cũng khác nhau. - Ở tất cả các mật độ vi khuẩn thí nghiệm đều có cá chết ngoại trừ đối chứng không tiêm (Hình 4). - Cá thí nghiệm bắt đầu chết vào ngày đầu tiên gây cảm nhiễm ở mật độ 10 5 CFU/ml sau 8 giờ gây cảm nhiễm. - Tuy nhiên, kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy cá không bị nhiễm vi khuẩn. - Như vậy, cá chết có thể do bị sốc vì thao tác tiêm vi khuẩn. - theo ngày cảm nhiễm. - Hình 5: A: Dấu hiệu bệnh lý của cá thí nghiệm cảm nhiễm. - Sau 14 ngày theo dõi thí nghiệm, ở mật độ tiêm vi khuẩn 10 6 CFU/ml cá chết 100%, tỉ lệ chết thấp nhất (20%) ở mật độ tiêm vi khuẩn 10 1 CFU/ml. - Riêng bể tiêm nước muối sinh lý cũng có cá chết, tuy nhiên chỉ có 1 con cá chết (10%) vào ngày thứ 12 sau khi tiêm chứng tỏ nguyên nhân cá chết không phải do thao tác tiêm hay do cảm nhiễm vi khuẩn mà có thể do môi trường nước và tỉ lệ chết này là không đáng kể so với các nghiệm thức còn lại. - Từ kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định được giá trị LD 50 của chủng vi khuẩn ĐH1não là 4,89x10 4 CFU/ml.. - Cá chết ở thí nghiệm cảm nhiễm có dấu hiệu bệnh lý giống nhau là tách đàn, bỏ ăn và bơi lội lờ đờ trên mặt nước. - Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có một số biến đổi. - Mô thận cá điêu hồng có nhiều vùng bị biến đổi cấu trúc, ống thận bị hoại tử (Hình 5D).. - Những con cá gần chết sau khi gây cảm nhiễm được giải phẫu và tái phân lập vi khuẩn ở thận trước của cá trên môi trường BHIA sau 24 giờ ở nhiệt độ 30C.. - Khuẩn lạc ở các đĩa BHIA có màu sắc và hình dạng khuẩn lạc tương tự nhau là màu kem, hình tròn, lồi, kích thước 1 mm, giống với khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ mẫu cá điêu hồng bệnh lúc thu mẫu. - Vi khuẩn tái phân lập được từ những cá bệnh trong khoảng 24 -48 giờ sau khi cảm nhiễm được xác định là có các chỉ tiêu hình thái sinh lý, sinh hóa và kiểu huyết thanh giống như chủng vi khuẩn cảm nhiễm S. - Chín chủng vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng bệnh có những đặc tính chung của nhóm vi khuẩn Streptococcus là Gram dương, có hình cầu, không có khả năng di động trong môi trường lỏng, cho phản ứng oxidase và catalase âm tính, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, mọc trên môi trường thạch máu nhưng không có gây tan huyết (Barrow và Feltham, 1993, Buller, 2004). - Các đặc tính sinh hóa này giúp phân biệt vi khuẩn S. - Thêm vào đó, tất cả các chủng đều cho phản ứng ngưng kết dương tính với kiểu huyết thanh Ib (kiểu sinh học 2) góp phần khẳng định các chủng vi khuẩn phân lập được là S. - Sự hiện diện cầu khuẩn gram dương nằm rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên vùng mô kính phết thận khi nhuộm Gram cũng được mô tả ở cá chim bạc Pampus argenteus và điêu hồng nhiễm S. - Hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc, hoại tử và xuất dịch viêm ở gan, thận và tỳ tạng cho thấy khả năng gây bệnh ở mức tế bào của vi khuẩn S. - Khả năng gây bệnh xuất huyết trên cá điêu hồng của chủng vi khuẩn S. - agalactiae trong nghiên cứu này tương tự như kết quả cảm nhiễm S. - Nhóm tác giả này đã tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn S. - (2008) đã gây cảm nhiễm trên cá điêu hồng có trọng lượng trung bình từ 85-100g với ở các nồng độ từ CFU/ml và xác định được vi khuẩn gây chết ở nồng độ 3x10 6 CFU/ml, cá bắt đầu chết sau 24 giờ tiêm vi khuẩn. - Cùng thí nghiệm này Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn (2009) sử dụng vi khuẩn S. - Ngoài thời điểm biểu hiện bệnh lý thì tỷ lệ chết cũng phản ánh khả năng gây bệnh của vi khuẩn. - (2005) cá chết với tỷ lệ cao nhất là 90% khi tiêm vi khuẩn với mật độ 10 8 CFU/ml và thấp nhất là 20%. - khi tiêm vi khuẩn ở mật độ 10 1 CFU/ml.. - Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu cá điêu hồng có dấu hiệu xuất huyết và phù mắt là S. - Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm xác định các chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá khỏe trong điều kiện cảm nhiễm thực nghiệm giống như dấu hiệu bệnh ở cá thu từ bè nuôi. - Giá trị LD 50 của chủng vi khuẩn S