- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG NHÃN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POTASSIUM CHLORATE. - Đất vườn nhãn, gen 16S- rRNA, hóa hướng động, phân hủy potassium chlorate, vi khuẩn. - Mười bốn dòng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất vườn nhãn ở quận Cái Răng, Cần Thơ có khả năng phân hủy KClO 3 , trong đó 7 dòng tạo sinh khối cao trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm). - Trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung KClO 3 và glucose, hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn cao hơn so với thí nghiệm không bổ sung glucose. - Khi chủng vi khuẩn vào đất đã khử trùng có bổ sung KClO 3 (375 ppm) và glucose (750 ppm), 2 dòng vi khuẩn CR10 và CR8 cũng có hiệu suất phân hủy KClO 3 cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại, đạt 94,4%. - Trong 2 dòng vi khuẩn tiềm năng, dòng CR8 có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 . - Phân tích trình tự gen 16S-rRNA cho thấy dòng vi khuẩn CR8 thuộc chi Enterobacter và được định danh là Enterobacter sp. - Phân lập và xác định đặc tính của vi khuẩn trong đất trồng nhãn có khả năng phân hủy potassium chlorate. - Đã có nhiều nghiên cứu về khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn được phân lập từ hệ thống xử lý nước thải phòng thí nghiệm như Ideonella dechloratans (Malmqvist et al., 1994), Pseudomonas chloritidismutans ASK-1 (Wolterink et al., 2005) và Alicycliphilus denitrificans BC (Weelink et al., 2008). - Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, khảo sát khả năng hóa hướng động và định danh vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy hiệu quả KClO 3 trong đất trồng nhãn ở khu vực quận Cái Răng, Cần Thơ.. - 2.2 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - Vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3 được phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu (MM) có bổ sung KClO 3 (100 ppm). - Quá trình nuôi cấy này được lặp lại 4 lần trước khi trải vi khuẩn lên môi trường MM có bổ sung KClO 3 để phân lập thuần (Breugelmans et al., 2004).. - Sau 4 lần nuôi cấy, dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến 10 -5 (hệ số pha loãng 10), 50 L dịch vi khuẩn ở từng độ pha loãng được trải lên môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm). - Phân nhóm khuẩn lạc vi khuẩn theo hình thái và chọn các khuẩn lạc rời để cấy chuyển nhiều lần theo phương pháp cấy ria trên môi trường MM có bổ sung KClO 3. - cho đến khi chọn được các dòng vi khuẩn có khuẩn. - Độ thuần của các dòng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng cách quan sát độ đồng nhất của khuẩn lạc trên môi trường Tryptone soya agar (TSA) (Breugelmans et al., 2004). - Các dòng vi khuẩn có khả năng tạo sinh khối nhanh được tuyển chọn bằng cách chủng khuẩn lạc của từng dòng vi khuẩn vào ống nghiệm 15 mL chứa 4 mL môi trường Trypton Soy Broth (TSB) và nuôi cấy qua đêm. - Vi khuẩn được thông khí trên máy lắc tròn (125 vòng/phút) ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm. - Sau đó, mật độ quang của vi khuẩn (OD 600nm ) được điều chỉnh về cùng giá trị 0,8 (tương đương 10 8 CFU/mL). - Chủng 50 µL từng dòng vi khuẩn vào môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm). - Các ống nghiệm chứa vi khuẩn nuôi cấy tương tự như trên. - Mật độ quang của vi khuẩn (OD 600nm ) được xác định sau 2 ngày nuôi cấy.. - của vi khuẩn trong môi trường MM. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường MM được khảo sát trong 7 ngày nuôi cấy. - Các dòng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong bình tam giác 100 mL chứa 30 mL môi trường TSB (20 g/L), thông khí trên máy lắc tròn (125 vòng/phút) trong 24 giờ. - Sinh khối vi khuẩn được thu bằng cách ly tâm 10 mL mẫu nuôi cấy (13.000 vòng/phút) trong 5 phút. - Sau đó, sinh khối vi khuẩn được trộn đều với 5 mL dung dịch NaCl 0,9%. - Mật độ quang (OD 600nm ) của từng dòng vi khuẩn được điều chỉnh về cùng giá trị là 0,8. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn phân lập được khảo sát trong ống nghiệm 15 mL chứa 5 mL môi trường MM bổ sung KClO 3 (100 ppm) kết hợp với có hoặc không bổ sung glucose (2000 ppm).. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn. - của vi khuẩn trong đất khử trùng. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn phân lập được khảo sát trong 9 ngày trong môi trường đất được để khô tự nhiên và khử trùng.. - Các bước nuôi tăng sinh và điều chỉnh mật độ quang của vi khuẩn được tiến hành tương tự như mô tả ở. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn được khảo sát bằng cách chủng 500 µL huyền phù vi khuẩn (OD 600nm = 0,8) vào bình tam giác 250 mL chứa 40 g đất khử trùng được bổ sung 15 mL môi trường MM có hòa tan KClO 3 (375 ppm) và glucose (750 ppm). - Khả năng phân hủy KClO 3 của vi khuẩn phân lập được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử indigo carmine (Chiswell and Keller-Lehmann, 1993). - 2.5 Khảo sát khả năng hóa hướng động theo KClO 3 của vi khuẩn. - Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - hiệu quả được tuyển chọn để khảo sát khả năng hóa hướng động theo KClO 3 trên môi trường khoáng tối thiểu bán đặc (0,75% agar) có bổ sung tinh thể KClO 3 thành vòng tròn hoặc nửa vòng tròn với tâm là vị trí chủng vi khuẩn. - Vi khuẩn được ủ ở 32 o C. - Vi khuẩn có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 sẽ tạo sinh khối về vị trí có bổ sung tinh thể KClO 3 (Thí nghiệm được mô phỏng theo quy trình của phòng thí nghiệm Bộ môn Quản lý Đất và Nước, Đại Học Leuven, Bỉ).. - 2.6 Định danh vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S-rRNA. - Dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3 cao và hóa hướng động theo hợp chất này được tuyển chọn để định danh. - ADN của vi khuẩn được ly trích theo mô tả của Sambrook et al. - Trình tự ADN của vi khuẩn được phân tích bằng phầm mềm Geneious và được so sánh với gen tương ứng của các dòng vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu NCBI sử. - 3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - Sau 4 lần nhân sinh khối, chọn lọc và tuyển chọn, 14 dòng vi khuẩn đã được phân lập trong môi trường. - Khi được nuôi cấy trên môi trường TSA sau 48 giờ, khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn không đồng nhất, kích thước biến thiên từ 1 - 3 mm. - Tất cả các dòng vi khuẩn đều Gram âm và có khả năng chuyển động khi quan sát tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. - Trong 14 dòng vi khuẩn phân lập, 7 dòng được ký hiệu CR3, CR8, CR10, CR45, CR48, CR51 và CR84 có khả năng tạo sinh khối cao hơn các dòng còn lại khi được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm) sau 2 ngày nuôi cấy. - Các dòng vi khuẩn này được tuyển chọn để khảo sát khả năng phân hủy KClO 3 trong các thí nghiệm tiếp theo.. - Hình 1: Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn đại diện sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường TSA A: dòng CR10. - 3.2 Khả năng phân hủy KClO 3 của vi khuẩn trong môi trường MM. - Khả năng phân hủy KClO 3 của 7 dòng vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm) trong 7 ngày nuôi cấy được trình bày trong Hình 1.. - Trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 , hiệu quả phân hủy KClO 3 của 7 dòng vi khuẩn tăng dần theo thời gian nuôi cấy, và giữa các dòng vi khuẩn có khác biệt thống kê khi so sánh với nhau về khả năng phân hủy KClO 3 theo thời gian. - ngày, dòng vi khuẩn CR51 có hiệu quả phân hủy KClO 3 cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Năm dòng vi khuẩn gồm CR3, CR8, CR10, CR45 và CR48 không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Sự gia tăng sinh khối của vi khuẩn thông qua giá trị mật độ quang (OD 600nm ) khi được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 so với nghiệm thức đối chứng có chủng vi khuẩn nhưng không bổ sung KClO 3 chứng tỏ 7 dòng vi khuẩn tuyển chọn đều có khả năng sử dụng KClO 3 cho sự tăng trưởng (Bảng 1).. - Hình 2: Hiệu suất phân giải KClO3 của các dòng vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung KClO3 (100 ppm) theo thời gian. - Bảng 1: Mật độ quang của vi khuẩn theo thời gian khi được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung KClO 3. - 3.2.2 Môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose Khả năng phân hủy KClO 3 của 7 dòng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm) trong 7 ngày được trình bày trong Hình 2. - Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều phân hủy KClO 3 nhanh hơn so với môi trường chỉ bổ sung KClO 3 (100 ppm) (Hình 2). - Sau 4 ngày, hiệu suất phân hủy đạt trên 60% ở các dòng vi khuẩn CR3, CR8, CR10 và CR51 tương. - Hiệu suất phân hủy KClO 3 của 4 dòng vi khuẩn này tiếp tục tăng nhanh đến ngày 6 và đạt tối đa ở ngày 7 (trên 95. - trong đó dòng vi khuẩn CR10 và CR8 có hiệu quả phân hủy KClO 3 cao nhất tương ứng với hiệu suất 99,8% và 97,4%, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Các dòng vi khuẩn CR3, CR45 và CR51 không khác biệt về hiệu suất phân hủy KClO 3 khi so sánh với nhau (Hình 3).. - Hình 3: Hiệu suất phân giải KClO 3 của các dòng vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung KClO 3. - Như vậy, 2 dòng vi khuẩn CR10 và CR8 được phân lập từ đất trồng nhãn ở quận Cái Răng có khả năng phân hủy KClO 3 hiệu quả hơn. - Sự khác nhau về khả năng phân hủy KClO 3 có thể do các dòng vi khuẩn được phân lập từ hai vùng trồng nhãn khác nhau đã được tiếp xúc với KClO 3 với thời gian và nồng độ không giống nhau. - Ngoài ra, các dòng vi khuẩn phân lập có thể thuộc các loài khác nhau nên khả năng phân hủy KClO 3 của chúng cũng khác nhau.. - Nhìn chung các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm) có khả năng phân hủy KClO 3. - Khi so sánh 3 dòng vi khuẩn phân hủy KClO 3 hiệu quả gổm CR8, CR10 và CR51 cho thấy hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn này cao hơn khi môi trường được bổ sung glucose, tương ứng đạt 97,4%;. - Điều này có thể do glucose là nguồn carbon hữu dụng giúp gia tăng sinh khối của vi khuẩn dẫn đến tăng hiệu suất phân hủy KClO 3. - 3.3 Khả năng phân hủy KClO 3 của vi khuẩn trong đất. - Khả năng phân hủy KClO 3 của 7 dòng vi khuẩn trong môi trường đất đã khử trùng có bổ sung KClO 3. - Kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng vi khuẩn đều có hiệu suất phân hủy KClO 3. - Sau 5 ngày, hiệu suất phân hủy đạt trên 80% ở 2 dòng vi khuẩn CR10 và CR3 (88,7% và 80% tương ứng). - Hiệu suất phân hủy của 2 dòng vi khuẩn này tiếp tục tăng cao đến ngày thứ 7. - Đặc biệt đến ngày thứ 9, dòng vi khuẩn CR10 và CR8 có hiệu quả phân hủy KClO 3 cao nhất, đạt 94,4% và 93,7%, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Hình 4: Hiệu suất phân hủy KClO3 của các dòng vi khuẩn trong đất có bổ sung KClO3 (375 ppm) và glucose (750 ppm) theo thời gian. - của vi khuẩn. - Hai dòng vi khuẩn CR8 và CR10 có khả năng phân hủy KClO 3 cao nhất nên được tuyển chọn để khảo sát khả năng hóa hướng động theo KClO 3. - Kết quả khảo sát cho thấy dòng CR8 có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 do dòng vi khuẩn này tạo. - Ngược lại, ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung KClO 3 , vi khuẩn CR8 chỉ tạo sinh khối ngay tại vị trí chủng ban đầu (Hình 5A). - Dòng vi khuẩn CR8 thể hiện sự tạo sinh khối hướng về vị trí bổ sung KClO 3 ở hai nghiệm thức bổ sung KClO 3 ở nửa vòng tròn (Hình 5B) và cả vòng tròn (Hình 5C) quanh vị trí chủng vi khuẩn.. - Hình 5: Hóa hướng động theo KClO3 của dòng vi khuẩn CR8 A. - Môi trường MM không bổ sung KClO3, có chủng vi khuẩn.. - Môi trường MM bổ sung KClO3 ở nửa vòng tròn, có chủng vi khuẩn.. - Môi trường MM bổ sung KClO3 ở cả vòng tròn, có chủng vi khuẩn.. - Theo Pandey and Jain (2002), các vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ ô nhiễm khác nhau như hydrocarbon một vòng và đa vòng thơm, alkan, nitroaromatics,. - Chẳng hạn, Bijdekerke (2004) và Sniegowski (2005) đã phân lập được vi khuẩn Pseudomonas stutzeri E1, Pseudomonas sp. - Vi khuẩn Novosphingobium sp. - Trong nghiên cứu này, dòng vi khuẩn CR8 vừa có khả năng phân hủy KClO 3 cao trong môi trường có bổ sung glucose vừa có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 nên CR8 là dòng vi khuẩn tiềm năng có thể được sử dụng cho các nghiên cứu ứng dụng để xử lý KClO 3 trong đất.. - 3.5 Định danh vi khuẩn. - (2006) về enzyme phân giải nitrate được ly trích từ màng tế bào của vi khuẩn Enterobacter cloacae dòng SLD1a-1 cũng có khả năng phân hủy hợp chất chlorate.. - Từ mẫu đất thu ở vườn trồng nhãn khu vực Khánh Hưng, phường Phú Thứ, quận Cái Răng, Cần Thơ, 14 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - đã được phân lập trong đó 7 dòng vi khuẩn có khả năng tạo sinh khối cao trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 (100 ppm) và glucose (2000 ppm).. - Trong môi trường MM có bổ sung KClO 3 và glucose, hiệu suất phân hủy KClO 3 của vi khuẩn cao hơn so với môi trường chỉ có KClO 3 . - Trong môi trường đất đã khử trùng có bổ sung KClO 3 (375 ppm) và glucose (750 ppm), 2 dòng vi khuẩn CR8 và CR10 cũng phân hủy KClO 3 cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại, đạt 93,7% và 94,4% sau 9 ngày nuôi cấy.. - Dòng vi khuẩn CR8 có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 và được định danh là Enterobacter sp.. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate kali từ đất trồng nhãn ở quận Thốt Nốt, Cần Thơ