- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS) CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS. - Bốn chủng vi khuẩn phân lập từ não cá rô đồng (Anabas testudineus) bệnh xuất huyết được định danh là Streptococcus agalactiae. - Các chủng vi khuẩn mọc trên môi trường brain heart infusion agar sau 24 giờ ở 30 C tạo khuẩn lạc tròn, lồi, màu kem, kích thước khoảng 1mm. - Kết quả ngưng kết miễn dịch xác định các chủng vi khuẩn phân lập được là S. - Kết quả cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm (mật độ 10 7 CFU/cá) cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh xuất huyết ở cá rô thí nghiệm như cá nhiễm bệnh tự nhiên.. - Từ khoá: Bệnh xuất huyết, cá rô đồng, Streptococcus agalactiae týp 2. - Cá rô đồng (Anabas testudineus) là loài cá bản địa vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và có tiềm năng nuôi tăng sản cao, thịt cá thơm ngon, có giá trị kinh tế và được nhiều người ưa chuộng. - Cá rô đồng được nuôi phổ biến ở các tỉnh ĐBSCL như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Hậu Giang. - rộng diện tích nuôi và sự thâm canh hóa nghề nuôi cá rô đồng cũng không tránh khỏi tình trạng dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và gây thiệt hại ngày càng nghiêm trọng hơn. - Trong số các bệnh thường gặp ở cá rô đồng thì bệnh xuất huyết là một trong những bệnh gây chết cá với tỉ lệ cao. - Trong số các vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá thì Aeromonas hydrophila là vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều loài cá nước ngọt như cá nheo (Ictalurus punctatus) (Ventura và Grizzle, 1987), cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) (Loan et al., 2009) và lươn đồng (Bin et al., 2010). - Bên cạnh đó, vi khuẩn Streptococcus sp. - Vi khuẩn Streptococcus có thể tấn công ở mọi giai đoạn phát triển của cá (Amal et al., 2008).. - Streptococcus là vi khuẩn có hình cầu, Gram âm rất đa dạng về thành phần loài và kiểu huyết thanh nên dễ nhầm lẫn với những nhóm cầu khuẩn khác về kiểu hình và đặc tính sinh lý, sinh hóa. - Do đó, việc xác định tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá không thể chỉ dựa vào dấu hiệu bệnh lý mà cần phải kết hợp với những xét nghiệm khác để xác định chính xác về tác nhân gây bệnh.. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh hóa, kiểu huyết thanh và khả năng gây bệnh xuất huyết của vi khuẩn S. - agalactiae týp 2 ở cá rô đồng nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị hiệu quả bệnh vi khuẩn ở đối tượng nuôi thủy sản này.. - 2.1 Phương pháp thu và phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm. - Mười hai mẫu cá rô đồng có dấu hiệu lờ đờ, xuất huyết được thu từ những ao nuôi cá rô đồng ở huyện Tháp Mười, Đồng Tháp và được vận chuyển trong thùng mướp có sục khí về phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. - Chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới được sử dụng để phân lập vi khuẩn.. - Trước khi phân lập vi khuẩn, mặt ngoài cơ thể cá được khử trùng bằng cồn 70 o và lau sạch. - Não cá cũng được phân lập vi khuẩn tương tự như gan và thận. - Các chủng vi khuẩn phân lập, sau khi tách ròng được trữ ở -80°C trong môi trường Brain heart infusion broth (BHIB, Merck) có chứa 25% glycerol. - Các chủng vi khuẩn được chọn để nghiên cứu tiếp theo được trình bày ở bảng 1.. - 2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn. - Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh vi khuẩn được trình bày ở bảng 2. - Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. - Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước cất lên lam, trãi đều lên lam một ít vi khuẩn, đậy bằng lammela và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X. - Bảng 1: Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô chọn nghiên cứu. - STT Mã PTN Nơi thu mẫu Cơ quan phân lập Năm thu mẫu. - 2.3 Xác định kiểu huyết thanh. - Kiểu huyết thanh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch bằng kit Strep-B-Latex (GBS) (Statens Serum Institut, Đan mạch) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng từ 3-5 khuẩn lạc cho vào 3ml nước muối sinh lý, lắc đều rồi nhỏ một giọt dung dịch vi khuẩn lên một lam. - Kết quả dương tính khi sử dụng Strep-B-Latex giúp xác định vi khuẩn Streptococus có kiểu huyết thanh Ib (serotype Ib) hay kiểu sinh học 2 (biotype 2).. - 2.4 Gây cảm nhiễm. - (2) nghiệm thức cảm nhiễm tiêm chủng vi khuẩn Cá1Não1 (0.1 ml/cá).. - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường BHIB 24 giờ ở 30 C. - Sau đó ly tâm 7500 vòng/phút trong 10 phút, rửa vi khuẩn 2 lần bằng dung dịch 0,85% và xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường BHIA (CFU/ml). - Mật độ gây cảm nhiễm là 10 7 CFU/cá, mỗi con cá được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở phần gốc vi ngực, theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong 7 ngày. - Những con cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để quan sát dấu hiệu bệnh lý, làm tiêu bản kính phết thận và tái phân lập và tái định danh vi khuẩn từ thận và não.. - 3 KẾT QUẢ. - 3.1 Dấu hiệu bệnh lý. - Mẫu bệnh phẩm thu được là cá lờ đờ, nổi đầu hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, trên thân có những đốm xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to, xoang bụng có chứa dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, mềm nhũn.. - 3.2 Phân lập vi khuẩn. - Kết quả phân lập từ não được 4 chủng vi khuẩn (Cá1Não1, Cá2Não, Cá3Não và Cá4Não). - Trên môi trường BHIA sau 48 giờ ở 30 o C vi khuẩn phát triển chậm thành các khuẩn lạc có hình tròn, lồi, màu kem, kích thước khoảng 1mm (Hình 1A). - Vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa 5% máu cừu nhưng không có khả năng gây tan huyết (Hình 1B).. - Kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh xuất huyết được trình bày ở bảng 2.. - Chúng là vi khuẩn Gram dương, hình cầu hay liên cầu, không di động, phản ứng âm tính với oxidasevà catalase, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí.. - Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep cho thấy tất cả các chủng cho phản ứng voges-proskauer, hippurate, β-glucuronidase, alkaline phosphatase và leucine aminopeptidase dương tính. - Dựa trên các chỉ tiêu sinh hóa và căn cứ vào mã số định danh của kit API 20 Strep, tất cả 4 chủng vi khuẩn được định danh là Streptococcus agalactiae. - Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, giống với vi khuẩn S. - Đặc biệt là kết quả âm tính với esculin là phản ứng sinh hóa nổi bật của vi khuẩn S.. - (kiểu huyết thanh Ib/kiểu sinh học 2) giúp xác định các chủng vi khuẩn phân lập được là S. - Hình 2: Kết quả ngưng kết miễn dịch. - 3.3 Khả năng gây bệnh xuất huyết ở cá rô của của vi khuẩn S. - agalactiae Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm cá rô đồng khỏe với chủng vi khuẩn Cá1Não1 cho thấy cá bắt đầu có dấu hiệu bệnh lý và chết vào ngày thứ hai sau khi tiêm vi khuẩn.. - Đến ngày thứ bảy sau khi tiêm vi khuẩn, tỉ lệ cá chết ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn là 70%. - Cá ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn có dấu hiệu bệnh lý giống nhau là tách đàn, bơi lội lờ đờ trên mặt nước, phản ứng chậm với tiếng động. - Mắt hơi lồi, xuất huyết ở gốc vây ngực (Hình 3A). - Hình 3: hiệu bệnh lý của cá 48 giờ sau tiêm vi khuẩn. - Ngoài ra, ở một số mẫu thận và não cá bệnh phát hiện vi khuẩn phá hủy màng tế bào (Hình 4B). - Kết quả này giống như khi phân lập vi khuẩn từ thận và não trên môi trường thạch BHIA. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh. - Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn. - Phản ứng lên men hiếu khí. - Mọc trên môi trường máu. - Phản ứng Voges-Proskauer. - Hình 4: Vi khuẩn trong thận của cá rô cảm nhiễm S. - Những con cá gần chết sau khi gây cảm nhiễm được giải phẫu để tái phân lập vi khuẩn ở thận và não. - Kết quả tái phân lập vi khuẩn từ thận và não của 10 mẫu cá bệnh từ bể cảm nhiễm trên môi trường BHIA sau 24 giờ ở nhiệt độ 30C thì được 16 đĩa có khuẩn lạc phát triển. - Khuẩn lạc ở các đĩa BHIA có màu sắc và hình dạng khuẩn lạc tương tự nhau là màu kem, hình tròn, lồi, kích thước 1 mm, giống với khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ mẫu cá rô bệnh xuất huyết lúc thu mẫu. - Các chủng vi khuẩn tái phân lập được tái định danh bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa và kiểu huyết thanh. - Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn tái phân lập được có các chỉ tiêu hình thái sinh lý, sinh hóa và kiểu huyết thanh giống như chủng vi khuẩn cảm nhiễm S. - Dựa vào tỉ lệ cá chết ở nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn, dấu hiệu bệnh lý, kính phết thận, kết quả tái phân lập và tái định danh cho thấy chủng vi khuẩn S.. - agalactiae Cá1Não1 có khả năng gây bệnh xuất huyết ở cá rô đồng giống như dấu hiệu bệnh lý của các mẫu cá bệnh được thu ở ao nuôi.. - Bốn chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh có những đặc tính chung của nhóm vi khuẩn Streptococcus là Gram dương, có hình cầu hay liên cầu, không có khả năng di động trong môi trường lỏng, cho phản ứng oxidase và catalase âm tính, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, mọc trên môi trường thạch máu nhưng không có gây tan huyết (Barrow và Feltham, 1993, Buller, 2004). - Các đặc tính sinh hóa này giúp phân biệt vi khuẩn S. - Thêm vào đó, tất cả các chủng đều cho phản ứng ngưng kết dương tính với kiểu huyết thanh Ib (kiểu sinh học 2) giúp xác định các chủng vi khuẩn phân lập được là S. - Kết quả này tương tự với kết quả của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2012) xác định vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng (Oreochromis sp) nuôi trong bè ở Cai Lậy, Tiền Giang bị bệnh phù mắt và xuất huyết là S. - Khả năng gây bệnh xuất huyết trên cá rô của các chủng vi khuẩn S. - agalactiae trong nghiên cứu này tương tự như kết quả cảm nhiễm S. - Nhóm tác giả này cũng ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý của cá sau 48 giờ cảm nhiễm là xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to. - Bên trong xoang bụng có chứa dịch, nội tạng bị xuất huyết. - agalactiae cũng làm chết cá rô phi (Oreochromis niloticus) với tỉ lệ 20-90% trong vòng 10 ngày sau khi tiêm với mật độ CFU/ml (Suanyuk et al., 2005).. - Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu cá rô đồng có dấu hiệu xuất huyết là S. - Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm xác định các chủng vi khuẩn này có khả năng gây xuất huyết cá rô đồng khỏe trong điều kiện cảm nhiễm thực nghiệm giống như dấu hiệu bệnh ở cá thu từ ao nuôi.. - Đặc điểm mô bệnh học ở cá điêu hồng (Oreochromis sp.) nhiễm vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong điều kiện thực nghiệm.. - Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp.) bệnh phù mắt và xuất huyết