- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN (CLOSTRIDIUM BOTULINUM). - TỪ VỊT VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN THẢ TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ. - A study on isolation and antibiotic sensitivity determination of Clostridium botulinum from scavenging ducks and environment in Vinh thanh, Co do and Thoi lai districts was carried out from January 2009 to September 2011. - The results showed that Clostridium botulinum was found from duck gut samples and of mud samples from ponds and canals. - Rate of isolation of Clostridium botulinum from ducks and mud was highest in Codo (21,05. - Clostridium botulinum was isolated from 43, 66%. - The results of antibiotic sensitivity testing of 20 Clostridium botulinum isolates showed that all were susceptible to ceftiofur, fosformycin and cephalexin but fully resistant to ampicillin.. - Title: Isolation and antibiotic sensitivity determination of Clostridium botulinum from ducks and environment in Cantho city. - Nghiên cứu phân lập và xác định tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt và môi trường chăn thả ở huyện Vĩnh Thạnh, Thới Lai và Cờ Đỏ được thực hiện từ tháng 01/2009 đến tháng 12/2011. - Kết quả đã phân lập Clostridium botulinum mẫu ruột vịt và mẫu bùn) từ nơi chăn thả vịt. - Tỷ lệ phát hiện Clostridium botulinum từ vịt và bùn cao nhất được ghi nhận ở huyện Cờ Đỏ (21,05. - Clostridium botulinum phân lập được từ vịt có triệu chứng bệnh cũng như từ vịt khỏe mạnh. - Tỷ lệ phát hiện Clostridium botulinum từ vịt bệnh là 43, 66% cao hơn so với từ vịt khỏe (7,47%) có ý nghĩa thống kê (P<0,001). - Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của 20 phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum đối với kháng sinh cho thấy 100% vi khuẩn nhạy cảm với ceftiofur, fosformycin và cephalexin và tất cả đều đề kháng với ampicillin.. - Trong vài năm gần đây, bệnh nhiễm độc tố vi khuẩn (Clostridium botulinum) hay còn được gọi là chứng cổ mềm (limberneck) xảy ra ngày càng phổ biến, gây chết nhiều vịt với triệu chứng liệt mềm cổ, liệt mí mắt trong, liệt cánh và chân được người chăn nuôi địa phương gọi với tên là bệnh “cúm cần”. - Clostridium botulinum sản sinh. - Nha bào Clostridium botulinum thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng trầm tích và trong cơ thể các động vật không xương sống, xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và dưới nước (Todar, 2009). - Do vậy có nhiều khả năng vi khuẩn này và độc tố của nó là nguyên nhân gây ra bệnh ở vịt khi chúng ăn phải vi khuẩn và độc tố của nó từ xác động vật có xương sống, các loài động vật không xương sống hoặc từ cây thủy sinh thối rữa tại nơi chăn thả.. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích phân lập vi khuẩn gây bệnh, xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh nhằm cung cấp những thông tin cần thiết trong việc lựa chọn kháng sinh để phòng và trị bệnh và làm cơ sở khoa học cho các bước nghiên cứu tiếp theo.. - 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện. - 2.1.2 Mẫu vật nghiên cứu. - Mẫu ruột vịt (352 mẫu) bao gồm 71 mẫu từ những vịt có triệu chứng bệnh “cúm cần” và 281 vịt khỏe, và 105 mẫu bùn từ môi trường chăn nuôi có vịt bệnh.. - Túi dùng để tạo môi trường nuôi yếm khí (Anaerocult C) (Merck, Mỹ).. - Các loại hóa chất nhuộm Gram, môi trường dùng vận chuyển và nuôi cấy vi khuẩn yếm khí: môi trường thioglycolate, môi trường NB (nutrient broth), môi trườngTSA (tryptic soy agar), ISA (iron sulphite agar), TPGY broth (5%. - Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar) dùng thực hiện kháng sinh đồ (Merck, Germany).. - 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - 2.2.1 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Clostridium botulinum Phương pháp lấy mẫu. - Mẫu ruột của vịt được lấy từ những con vịt nghi mắc bệnh có biểu hiện triệu chứng nghi bệnh do nhiễm độc tố của Clostridium botulinum với biểu hiện liệt mềm cổ, liệt mí mắt trong, liệt cánh và chân được người chăn nuôi địa phương gọi với tên là bệnh “cúm cần”. - Mẫu ruột vịt được lấy bằng cách dùng dây thun buộc hai đầu đoạn ruột phía trên chỗ giáp với mề và phía dưới giáp lỗ huyệt, sát trùng bên ngoài bằng cồn 700, sau đó cắt lấy toàn bộ ruột, cho vào môi trường chuyên chở thioglycolate đã hấp tiệt trùng và đuổi oxy, rồi cho vào thùng trữ lạnh mang về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.. - Bùn ở môi trường nuôi những đàn vịt bệnh đã được lấy mẫu ruột cũng được sử dụng để phân lập vi khuẩn. - Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn. - Cân 25g mẫu (ruột vịt hoặc bùn) nghiền trong 225ml nước sinh lý 0,9%, sau đó ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút, lấy 10g cặn cho vào 90ml môi trường NB, ủ yếm khí ở 37 o C trong 3 ngày. - Sau khi ủ, lấy ống canh khuẩn ra đem đun 80 0 C trong vòng 20 phút để giết chết các loại vi khuẩn khác, chỉ còn lại nha bào. - Hút 1ml canh khuẩn đã pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ làm 2 đĩa), đổ vào mỗi đĩa 15ml môi trường ISA đã tiệt trùng, xoay đĩa cùng và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn đều mẫu với môi trường. - Để cho đĩa thạch đặc lại, sau đó đổ tiếp 5ml môi trường ISA vào để tạo điều kiện yếm khí, tiếp tục ủ yếm khí 37 o C trong 24 – 48 giờ. - Chọn khuẩn lạc đen hoặc được bao quanh bởi vòng đen (đường kính lớn hơn 0,5 mm) cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ yếm khí ở 37 o C trong 24 giờ. - Sau đó định danh bằng phản ứng sinh hóa với kit API 20A (Trần Linh Thước, 2006), kết hợp với kết quả về 3 đặc tính khác đã được kiểm tra bao gồm: có khả năng hình thành nha bào, bắt màu Gram dương và hình que. - Bảng 1: Chỉ tiêu định danh vi khuẩn C. - 2.2.2 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C.botulinum phân lập. - Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966), dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (2007) và bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y-Dược Tp. - Hồ Chí Minh (2001) để đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh của 20 phân lập vi khuẩn C. - botulinum đối với 12 loại kháng sinh được xác định tính dựa vào đường kính vòng vô khuẩn được trình bày qua bảng 2.. - Bảng 2: Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh TT Loại kháng sinh Hàm lượng. - Phép thử Chi square được dùng để so sánh các tỷ lệ phân lập Clostridium botulinum.. - 3 KẾT QUẢ. - 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum. - 3.1.1 Kết quả phân lập Clostridium botulinum từ mẫu ruột vịt và bùn. - Kết quả phân lập C. - Bảng 3: Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum từ ruột của vịt và bùn nơi chăn thả. - Tỷ lệ. - Kết quả bảng 1 cho thấy đã phân lập vi khuẩn C. - Tỷ lệ phân lập vi khuẩn từ mẫu bùn cao hơn mẫu ruột nhiều và sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê (P=0,000). - botulinum là loại vi khuẩn sống hoại sinh từ các chất hữu cơ do xác động và thực vật thối rữa có trong bùn và đất (Gross, 1982), do đó chúng hiện diện thường xuyên ở những nơi trước đây đã có bệnh và môi trường có nhiều chất hữu cơ. - Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Dohms et al., (1982) trên gà cho thấy ở những trại trước đây đã có bệnh, C. - botulinum có thể phân lập được từ thức ăn, chất độn chuồng, gà bệnh lẫn gà khỏe, nhưng không thể phát hiện được C. - Tỷ lệ phân lập C. - 3.1.2 Kết quả phân lập Clostridium botulinum theo địa phương. - Bảng 4: Kết quả phân lập Clostridium botulinum theo địa phương. - chung Kết quả bảng 4 cho thấy C. - botulinum được phân lập ở tất cả các huyện khảo sát.. - Tỷ lệ phân lập cao nhất được ghi nhận ở huyện Cờ Đỏ (21,05. - Sự khác nhau về tỷ lệ phân lập C. - botulimum giữa các vùng đất ở nhiều quốc gia khác nhau được chứng minh bởi tác động của nhiều yếu tố môi trường. - Kết quả nghiên cứu của Midura (1996) cho thấy C. - botulinum type C rất ổn định trong môi trường có pH từ 3,5 – 6,5 cho nên vịt nuôi vùng đất chua phèn có nguy cơ nhiễm bệnh cao hơn.. - (1999) cho rằng chất sắt từ môi trường và thức ăn có liên quan đến tình hình nhiễm của C .botulinum vì chất sắt là yếu tố cần thiết cho nhiều vi sinh vật đường ruột phát triển mạnh hơn, trong đó có C. - Ngoài ra, nồng độ các thuốc diệt côn trùng và mật độ động vật không xương sống đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn C botulinum (Rocke and Samuel, 1999. - Tuy nhiên, qua phân tích thống kê, sự sai khác về tỷ lệ phân lập C.. - 3.1.3 Kết quả phân lập Clostridium botulinum từ vịt bệnh và vịt khỏe. - Bảng 5: Kết quả phân lập C. - dương tính Tỷ lệ. - Kết quả trình bày trong bảng 5 cho thấy C. - botulinum hiện diện ở cả mẫu ruột từ vịt khỏe với tỷ lệ 7,47% là do C. - botulinum là loại vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của các loài chim (Smith, 1978) và bào tử C. - Vi khuẩn chỉ hình thành độc tố gây chết gia cầm khi có những điều kiện thuận lợi cho bào tử nẩy mầm và sản sinh độc tố trong điều kiện yếm khí. - Nghiên cứu của Dohms et al. - botulinum có thể phân lập được từ chất độn chuồng, thức ăn, mô của gia cầm chết do bệnh và cả ở gia cầm khỏe.. - Nếu so với các bệnh khác, thì tỷ lệ phân lập mầm bệnh từ những con có triệu chứng điển hình của bệnh này (43,66%) là khá thấp, có thể lý giải bởi đặc điểm bệnh lý của bệnh do độc tố botulin của vi khuẩn gây ra, bản thân vi khuẩn không trực tiếp gây bệnh (Gross, 1982).. - Do đó, mặc dù vịt có triệu chứng bệnh nhưng không phát hiện được vi khuẩn sản sinh độc tố trong cơ thể. - Kết quả khảo sát trên 93 trường hợp vịt trời chết ở sông Hangang, Hàn Quốc với triệu chứng điển hình và Woo et al. - (2010) phát hiện được độc tố botulin type C từ những vịt trời này, nhưng không phân lập được vi khuẩn từ tất cả con vật bệnh. - Ngoài ra, vịt cũng có thể mắc bệnh do ăn phải bào tử hoặc vi khuẩn C. - botulinum nếu sức đề kháng vịt giảm do stress hoặc virus, có điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm trở thành dạng vi khuẩn sinh dưỡng nhân lên với số lượng lớn và tiết độc tố gây bệnh vịt (Okamoto, 1999). - Kết quả nghiên cứu sử dụng bào tử Clostridium botulinum types B, C, và E cho vịt Bắc Kinh uống cho thấy botulin được sản xuất và giết chết vịt sau khi cho vịt uống nha bào và nồng độ botulin cao nhất sau khi vịt được uống nha bào sau 40 phút (Notermans et al. - 3.2 Kết quả kiểm tra độ mẫn cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập được. - Kết quả khảo sát tính nhạy cảm đối với kháng sinh của 20 phân lập vi khuẩn C.botulinum được trình bày ở bảng 6.. - Kết quả ở bảng 6 cho thấy chủng vi khuẩn C. - kháng sinh khác ít có tác dụng, đáng chú ý là 100% chủng C. - Bảng 6: Kết quả kháng sinh đồ đối với Clostridium botulinum. - TT Kháng sinh Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc Số mẫu Tỷ lệ. - Số mẫu Tỷ lệ. - Do C.botulinum là vi khuẩn thường trú trong hệ tiêu hoá của vịt nên các loại kháng sinh đã được sử dụng điều trị bệnh hoặc bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh cho vịt đều có tác dụng gây nên những biến đổi di truyền hình thành các chủng C.. - Do đó, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác nhau về tính mẫn cảm và đề kháng của C. - botulinum đối với kháng sinh và phụ thuộc vào thời điểm và địa phương khảo sát (Page, 1975. - Nên những thông tin về tính nhạy cảm và đề kháng đối với từng chủng vi khuẩn cụ thể là những số liệu hữu ích cho những người làm công tác điều trị.. - Clostridium botulinum hiện diện phổ biến trong đường tiêu hóa vịt, đặc biệt trong bùn từ môi trường chăn thả vịt tại các địa phương thuộc thành phố Cần Thơ.. - Để phòng-trị bệnh “cúm cần” cho vịt nên sử dụng các loại kháng sinh ceftiofur, fosformycin hoặc cephalexin vào những thời điểm có nguy cơ xảy ra bệnh.. - “Kháng sinh đồ bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh với đĩa ĐSK –dics”, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.. - “Infant botulism: identification of Clostridium botulinum and its toxin in faeces”, Lancet II, pp. - “Clostridium botulinum in aquatic environment in Great Britain and Ireland”, Journal of Hygiene ,80, pp