- PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHLORATE KALI TỪ ĐẤT TRỒNG NHÃN Ở QUẬN THỐT NỐT, CẦN THƠ. - Đất trồng nhãn, hóa hướng động, vi khuẩn phân hủy chlorate kali. - Hai mươi bốn dòng vi khuẩn được phân lập từ đất trồng nhãn ở quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ trong đó bảy dòng vi khuẩn có khả năng tạo sinh khối cao trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L) và glucose (2 g/L), các dòng này đều là vi khuẩn Gram âm. - Trong môi trường khoáng tối thiểu bổ sung KClO 3 , các dòng vi khuẩn đạt hiệu suất phân hủy KClO 3 cao nhất (70,4. - Trong môi trường có bổ sung KClO 3 và glucose, hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn cao hơn, đạt 65,8. - Dòng TN3 có hiệu suất phân hủy KClO 3 cao nhất trong môi trường không bổ sung glucose (77,6% sau 11 ngày nuôi cấy) và trong môi trường có bổ sung glucose (78,6% sau bảy ngày nuôi cấy). - Khảo sát khả năng hóa hướng động cho thấy hai dòng vi khuẩn TN3 và TN34 có khả năng di chuyển về phía có bổ sung KClO 3 . - Kết quả nghiên cứu chứng tỏ dòng TN3 phân hủy KClO 3 cao nhất so với các dòng vi khuẩn khảo sát và có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 nên TN3 được xem là dòng vi khuẩn tiềm năng cho các nghiên cứu ứng dụng về phân hủy sinh học KClO 3 lưu tồn trong đất.. - Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate kali từ đất trồng nhãn ở quận Thốt Nốt, Cần Thơ. - Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate đã được nghiên cứu như Ideonella dechloratans (Malmqvist et al., 1994), Azospira oryzae GR-1 (Rikken et al., 1996), Wolinella succinogenes HAP-1 (Wallace et al., 1996) và Dechlorimonas agitatus CKB (Bruce et al., 1999) chủ yếu được phân lập từ bể xử lý nước thải. - Chính vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu là phân lập và khảo sát khả năng phân hủy KClO 3. - của các dòng vi khuẩn từ đất trồng nhãn với thời gian sử dụng chlorate lâu năm ở quận Thốt Nốt, Cần Thơ nhằm tìm ra các dòng vi sinh vật tiềm. - 2.2 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - Vi khuẩn phân hủy KClO 3 được phân lập theo phương pháp chọn lọc trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L). - Ở lần chọn lọc thứ tư, dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến nồng độ 10 -5 (theo hệ số pha loãng 10), 50 µL dịch vi khuẩn ở từng nồng độ pha loãng được cấy trải trên môi trường tối thiểu đặc có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L) và ủ ở 32 o C trong bốn ngày.. - Khi các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển, chọn những khuẩn lạc rời có đặc điểm hình thái và kích thước khác nhau để phân lập thuần bằng phương pháp cấy ria. - Độ thuần của các dòng vi khuẩn được kiểm tra bằng cách quan sát độ đồng nhất của khuẩn lạc trên môi trường tryptone soya agar (TSA). - Tế bào của các dòng vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học và nhuộm Gram.. - 2.3 Khảo sát khả năng tạo sinh khối của vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung KClO 3 và glucose. - Khuẩn lạc của từng dòng vi khuẩn được chủng vào 4 mL môi trường tryptone soya broth (TSB) và nuôi cấy qua đêm. - Vi khuẩn được thông khí trên máy lắc với vận tốc 125 vòng/phút trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Sau đó, mật độ quang của vi khuẩn (OD 600nm ) được điều chỉnh về cùng giá trị là 0,7. - Khảo sát khả năng tạo sinh khối bằng cách chủng 50µL dịch vi khuẩn vào môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L) và glucose (2 g/L), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. - Vi khuẩn cũng được nuôi cấy trong điều kiện tương tự như trên. - Mật độ quang của vi khuẩn (OD 600nm ) được xác định sau 2 ngày nuôi cấy.. - 2.4 Khảo sát khả năng phân hủy KClO 3 của vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng được khảo sát trong 7 ngày nuôi cấy. - Các dòng vi khuẩn được nuôi trong bình tam giác 100 mL chứa 30 mL môi trường TSB (20 g/L) để nhân mật số vi khuẩn trước khi bố trí thí nghiệm. - Sau đó, tiến hành thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. - Sinh khối vi khuẩn được trộn đều với dung dịch NaCl 0,9%.. - Mật độ quang (OD 600nm ) của từng dòng vi khuẩn được điều chỉnh về cùng giá trị là 0,7. - Khảo sát khả năng phân hủy KClO 3 (0,1 g/L) của các dòng vi khuẩn phân lập được bố trí trong ống nghiệm 15 mL tiệt trùng chứa 5 mL môi trường khoáng tối thiểu có hoặc không bổ sung glucose (2 g/L). - Hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử indigo carmine để định lượng nồng độ KClO 3 còn lại trong môi trường nuôi cấy.. - Sau mỗi 48 giờ, 500 μL dịch vi khuẩn ở các nghiệm thức được thu và ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 5 phút. - 2.5 Khảo sát khả năng hóa hướng động theo KClO 3 của vi khuẩn. - Khả năng hóa hướng động của vi khuẩn theo KClO 3 được khảo sát trên môi trường khoáng tối thiểu bán đặc (0,75% agar) có bổ sung tinh thể KClO 3 . - Sau đó, dùng kẹp gấp giấy lọc ra khỏi môi trường và chủng vi khuẩn vào tâm của vòng tròn hoặc nửa vòng tròn đã bổ sung KClO 3. - Vi khuẩn được ủ trong tủ ủ ở 32 o C, sự di chuyển và hình thành sinh khối của vi khuẩn được quan sát theo thời gian. - Vi khuẩn biểu hiện khả năng hóa hướng động theo KClO 3 sẽ tạo sinh khối về phía môi trường có bổ sung tinh thể KClO 3 và không tạo sinh khối về phía không có sự hiện diện của tinh thể KClO 3 (Thí nghiệm được mô phỏng theo quy trình của phòng thí nghiệm Bộ môn quản lý Đất và Nước, Đại học Leuven, Bỉ).. - Hình 1: Khảo sát khả năng hóa hướng động của vi khuẩn theo KClO 3. - Vi khuẩn được chủng vào tâm vòng tròn và nửa vòng tròn đã bổ sung KClO 3. - 3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3. - Sau bốn lần chọn lọc, 24 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L), trong đó, bảy dòng vi khuẩn gồm TN2, TN3, TN5, TN6, TN7, TN9 và TN34 có mật độ quang (OD 600nm ) cao hơn các dòng còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L) và glucose (2 g/L) sau 2. - Chính vì vậy, bảy dòng vi khuẩn có khả năng tạo sinh khối cao được sử dụng để khảo sát hiệu suất phân hủy KClO 3 và khả năng hóa hướng động theo KClO 3 . - Về đặc điểm hình thái, sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA, bảy dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu trắng hoặc vàng, bìa nguyên, độ nổi mô, đường kính trung bình từ 0,5 - 2 mm. - Tế bào của bảy dòng vi khuẩn đều có dạng que ngắn, Gram âm và có khả năng chuyển động.. - Bảng 1: Mật độ quang (OD 600nm ) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy. - Vi khuẩn TN2 TN3 TN5 TN6 TN7 TN9 TN34. - 3.2 Khả năng phân hủy KClO 3 của vi khuẩn. - Khả năng phân hủy KClO 3 trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 (0,1 g/L) của bảy dòng vi khuẩn được khảo sát trong 11 ngày nuôi cấy. - Sau một ngày, hiệu suất phân hủy KClO 3. - của các dòng vi khuẩn còn thấp, trong đó dòng TN9 phân hủy KClO 3 đạt 10,6%, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. - Sau ba ngày, dòng TN7 phân hủy KClO 3 cao nhất (33,6. - Ở ngày thứ năm, hiệu suất phân hủy KClO 3 của tất cả bảy dòng tăng cao (39,4. - TN7 phân hủy KClO 3 cao nhất (54,4%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. - Khả năng phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn tiếp tục tăng sau bảy ngày nuôi cấy, trong đó dòng TN3 có hiệu suất phân hủy cao nhất (67,4. - Sau 11 ngày nuôi cấy, các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3 từ 70,4. - Vị trí chủng vi khuẩn. - Kết quả nghiên cứu cho thấy cả bảy dòng vi khuẩn đều có hiệu suất phân hủy KClO 3 tăng theo thời gian. - hủy KClO 3 cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại (Hình 3).. - Hình 3: Hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn trong môi trường không bổ sung glucose Các giá trị trung bình trong cùng một ngày theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. - Trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 và glucose, khả năng phân hủy KClO 3 của. - các dòng vi khuẩn còn thấp sau một ngày nuôi cấy, trong đó dòng TN9 phân hủy KClO 3 cao hơn các dòng còn lại (20,9. - Sau ba ngày, dòng TN34 đạt hiệu suất phân hủy KClO 3 cao nhất (51,7%) khác. - Hiệu suất phân hủy KClO3. - Hiệu suất phân hủy KClO 3(%). - Dòng vi khuẩn. - Đến ngày năm, hiệu suất phân hủy KClO 3 tăng (51,3. - Hiệu suất phân hủy KClO 3. - của các dòng vi khuẩn tăng cao sau bảy ngày nuôi cấy, trong đó dòng TN3 phân hủy cao nhất (78,6%). - Từ ngày 9 đến ngày 11, hiệu suất phân hủy KClO 3. - Sau 11 ngày nuôi cấy, sự phân hủy KClO 3 ở các dòng vi khuẩn khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (Hình 4).. - Nhìn chung, hiệu suất phân hủy ở hầu hết bảy dòng vi khuẩn đều tăng sau 11 ngày nuôi cấy.. - Trong đó, dòng TN3 có khả năng phân hủy KClO 3. - Hình 5: Hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn trong môi trường có bổ sung glucose Các giá trị trung bình trong cùng một ngày theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. - Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Hiệu suất phân hủy KClO 3(%). - Hiệu suất phân hủy KClO 3(%). - Dòng vi khuẩn. - Kết quả nghiên cứu cho thấy khi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung glucose, các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy KClO 3 nhanh hơn (78,6% sau bảy ngày nuôi cấy) so với nghiệm thức không bổ sung glucose (77,6% sau 11 ngày nuôi cấy). - Ở các dòng vi khuẩn này, chlorate đóng vai trò là chất nhận điện tử trong khi glucose là chất cho điện tử trong quá trình hô hấp tế bào của vi khuẩn phân hủy chlorate (Van Ginkel et al., 1995). - Sự dồi dào về nguồn cung cấp điện tử (glucose) làm cho chất nhận điện tử (KClO 3 ) hoạt động hiệu quả hơn nhờ vào chuỗi dẫn truyền điện tử hiện diện trong tế bào vi khuẩn. - Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh vi khuẩn Azospira sp. - thể phân hủy 18,8 mM chlorate (Kengen et al., 1999), thậm chí vi khuẩn Dechlorimonas agitatus CKB có thể phát triển trong môi trường có nồng độ chlorate lên đến 80 mM (Bruce et al., 1999). - Trong nghiên cứu này, các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate kali ở nồng độ 1 mM, thấp hơn nhiều so với các nghiên cứu trước đây. - Vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorate kali ở nồng độ rất thấp là những dòng vi khuẩn tiềm năng cho các nghiên cứu ứng dụng để xử lý KClO 3 tồn lưu trong đất.. - của vi khuẩn. - Trong bảy dòng vi khuẩn khảo sát, TN3 và TN34 có khả năng hóa hướng động theo KClO 3 . - Cả hai dòng vi khuẩn đều tạo sinh khối về phía KClO 3 khi KClO 3 được bổ sung ở nửa vòng tròn và cả vòng tròn (Hình 6B). - Ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung KClO 3 , các dòng vi khuẩn chỉ tạo sinh khối tại vị trí chủng ban đầu (Hình 6C).. - Hình 6: Khả năng hóa hướng động theo KClO 3 của dòng vi khuẩn TN34 A. - Môi trường có bổ sung KClO 3 ở nửa vòng tròn và cả vòng tròn trước khi chủng vi khuẩn. - Sau khi chủng, vi khuẩn tạo sinh khối về phía có bổ sung KClO 3. - Đối chứng không có KClO 3 , vi khuẩn chỉ tạo sinh khối tại vị trí chủng ban đầu Trong đất, các hợp chất hóa học thường phân. - Pandey and Jain (2002) đã chứng minh các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất ô nhiễm như hydrocarbon một vòng và đa vòng thơm, alkan, nitroaromatics và các loại thuốc trừ sâu gốc chlor cũng thể hiện khả năng hóa hướng động theo các hợp chất này. - Chẳng hạn, vi khuẩn Novosphingobium sp. - Ngoài ra, các dòng vi khuẩn như Pseudomonas stutzeri E1, Pseudomonas sp. - Chính vì vậy, dòng vi khuẩn TN3 có thể xem là dòng vi khuẩn tiềm năng cho các nghiên cứu ứng dụng về xử lý KClO 3 trong đất.. - Từ các mẫu đất thu tại vườn nhãn có sử dụng KClO 3 để kích thích nhãn ra hoa trái vụ thuộc quận Thốt Nốt, Cần Thơ, 24 dòng vi khuẩn được phân lập trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 , trong đó bảy dòng vi khuẩn tạo sinh khối cao trong môi trường có bổ sung KClO 3 và glucose. - Trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung KClO 3 , bảy dòng vi khuẩn đạt hiệu suất phân hủy KClO 3 cao nhất sau 11 ngày nuôi cấy (70,4. - Khi môi trường nuôi cấy có bổ sung KClO 3 và glucose, hiệu suất phân hủy KClO 3 của các dòng vi khuẩn cao nhất sau bảy ngày nuôi cấy (65,8. - Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng TN3 có khả năng phân hủy KClO 3 cao hơn so với các dòng vi khuẩn còn lại trong môi trường có hoặc không có bổ sung glucose đồng thời có khả năng hóa hướng động theo KClO 3