- Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Abstract: Tìm hiểu về ung thư đại trực tràng. - chỉ thị sinh học trong ung thư đại trực tràng. - các phương pháp nghiên cứu biến đổi gen liên quan đến bệnh ung thư;. - Chemokine CXCL12 và vai trò trong ung thư đai trực tràng. - Tìm hiểu các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND tổng số tứ mô, từ máu, khuyếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR.. - Phân tích RFLP, khuyếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP cũng như dự đoán cùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phien mã của gen CXCL12. - Đưa ra kết quả phân tích PCR-RFLP và kết quả phân tích tình trạng METHYL hóa gen CXCL12.. - Gen CXCL12. - Bệnh nhân. - Ung thư Content. - Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. - Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. - Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn rất tốn kém[7].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. - Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:. - Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:. - Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, so sánh với các mẫu đối chứng.. - Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam.. - Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:. - Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.. - Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.. - Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam.. - Nguyên liệu và phương pháp. - Mẫu mô ung thư đại trực tràng lấy tại vị trí khối u. - Mẫu so sánh là mô đại trực tràng lân cận, cách 5-10cm so với vị trí khối u đó. - Tổng cộng 25 mẫu mô được phân tích.. - Máu người bình thường và người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đã được chống đông bằng EDTA. - Cặp mồi CXCL12 dùng cho phân tích đa hình (F, R) (IDT, Mỹ), Agarose do hãng Invitrogen (Mỹ) cung cấp.. - Cặp mồi CXCL12 (U-f, U-r, M-f, M-r) (IDT, Mỹ) dùng cho phân tích methyl.. - Tất cả các hóa chất được sử dụng đều có độ sạch phân tích.. - 2.Phương pháp nghiên cứu. - Tách chiết ADN tổng số từ mô. - Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.. - Tách chiết ADN tổng số từ máu. - ADN tổng số được tách chiết từ máu theo phương pháp của PitroChomczy và Nicoleta Sacchi [5] bằng cách dùng phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1). - Phương pháp phân tích PCR- RFLP. - Trình tự cặp mồi được tham khảo theo tài liệu công bố của Dimberg va cs để nhân đoạn gen CXCL12 dùng cho phân tích đa hình.. - Sản phẩm PCR được sử dụng để phân tích RFLP.. - Phân tích RFLP. - Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12. - Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng là cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, được tham khảo từ bài báo của Wendt và cs và đã được kiểm tra lại sử dụng phần mềm MethBLAST và MethPrimer.. - Cặp mồi được thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo MethPrimer) nằm trong vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự như sau:. - Phân tích kết quả bằng phương pháp thống kê. - Sử dụng phép kiểm định thống kê χ 2 với mức ý nghĩa α = 0,05 để đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen CXCL12 và tình trạng methyl hóa promoter của gen với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.. - Kết quả.. - Kết quả phân tích PCR- RFLP. - Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu. - Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, khá sắc nét và ít bị đứt gẫy. - Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR. - Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12 (Điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide) Giếng M. - Từ hình ảnh điện di, ta thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước 302 bp. - Kết quả phân tích RFLP. - Để phát hiện được tính đa hình trong đoạn gen CXCL12 sau khi khuếch đại đoạn gen này bằng phương pháp PCR, chúng tôi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme MspI. - Kết quả được thể hiện ở hình 5.. - ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp. - Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme MspI.. - Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê. - Qua quá trình nghiên cứu và sử lý số liệu chúng tôi nhận thấy ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng có sai khác mang ý nghĩa thống kê về kiểu gen và tần suất alen, điều đó chứng tỏ đã có sự thay đổi đáng kể trong kiểu gen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng, và sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của CXCL12 trong ung thư đại trực tràng.. - Kết quả phân tích MSP. - Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô. - Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp ADN Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức), chúng tôi đã tách chiết được ADN từ 25 cặp mẫu mô của 25 bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, đều sắc nét và rất ít bị đứt gẫy. - Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12. - Chúng tôi tiến hành phân tích trên một đoạn trình tự dài 3000 nu (từ nucleotide 3001 đến 6001). - Sử dụng phần mềm MethPrimer (Li Lab, UCSF) và phần mềm cpgplot (EMBOSS) để dự đoán các đảo CpG thuộc đoạn trình tự trên với các tiêu chuẩn (kích thước mỗi đảo ≥ 100 bp, tỷ lệ GC ≥ 50% và tỷ số CpG giữa giá trị quan sát trên giá trị mong đợi ≥ 0,6), chúng tôi thu được kết quả như sau. - Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer [6]. - Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot (EMBOSS)[4]. - Kết quả khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP. - ảnh điê ̣n di sản phẩm PCR của gen CXCL12 (điê ̣n di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc). - giếng 1-4: Bệnh nhân số 1 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô lân cận u). - giếng 5-8: Bệnh nhân số 2 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô u). - giếng 2,4,6,8: Methyl.Trong đó Giếng 1, 2 là khảo sát trên mô u của bệnh nhân 1. - Giếng 3, 4 là trên mô lân cận u của bệnh nhân số 1.. - Như vậy, bằng kỹ thuật MSP, chúng tôi đã nhân thành công trình tự nằm trong vùng promoter của gen CXCL12.. - Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở bênh ung thư đại trực tràng. - Chúng tôi đã tiến hành phân tích MSP thành công trên 25 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong đó có 20 mẫu khảo sát trên mô bệnh lấy tại vị trí ung thư của người bệnh và 16 mẫu trên mô lân cận cách 5cm so với vị trí ung thư, có 11/25 bệnh nhân được khảo sát thành công trên cả mô u và mô lân cận u.. - Như vậy, qua thống kê ta thấy đối với riêng 11 bệnh nhân khảo sát thành công trên cả mô u và lân cận u thì tỷ lệ methyl hóa xảy ra tại vùng promoter của gen CXCL12 trên mô u là cao hơn hẳn (chiếm 63,63%) so với tỷ lệ đó trên mô lân cận u (chiếm 27,3). - Trong khi đó, tỷ lệ unmethyl trên mô lân cận u lại cao (chiếm 72,7. - Tính chung trên cả mô u và lân cận u ở 11 bệnh nhân trên thì có 9 bệnh nhân (chiếm 81,81%) là bị methyl hóa trên một trong hai mô và chỉ có 2 bệnh nhân (chiếm 19,19%) là không bị methyl hóa trên mô nào.. - Mô U Mô lân cận u. - Hình 8.Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u U: unmethyl. - Nhìn vào biểu đồ (hình 13) ta thấy rõ hơn sự khác biệt về tỷ lệ methyl và unmethyl giữa 2 loại mô u và lân cận u. - Đối vối mô lân cận u thì tỷ lệ methyl lại thấp hơn (37,5%) so với tỷ lệ unmethyl (62,5%).. - Tổng kết chung trên 25 bệnh nhân đã khảo sát thành công thì có tới 21 bệnh nhân (chiếm 84%) bị methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12, trong khi chỉ có 4 bệnh nhân (chiếm 16%) không có sự methyl hóa trên cả hai mô. - Qua 11 mẫu bệnh nhân khảo sát thành công trên cả mô u và lân mô cận u ta thấy có những bệnh nhân xuất hiện cả băng methyl và unmethyl cùng lúc trên mô u hoặc mô lân cận u, những bệnh nhân như vậy gọi là bệnh nhân bị methyl hóa không hoàn toàn. - Còn những bệnh nhân có xuất hiện băng methyl trên cả mô u và mô lân cận u hoặc xuất hiện băng methyl trên mô u và unmethyl trên mô lân cận u là trường hợp bị methyl hóa hoàn toàn. - Qua so sánh tỷ lệ methyl hóa giữa mẫu u và mẫu lân cận u ta thấy sự sai khác về tỷ lệ methyl giữa 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê với p<0,05.. - Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:. - Sử dụng kĩ thuật PCR-RFLP, đã xác định được tính đa hình của gen CXCL12:. - Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen CXCL12 không phụ thuộc vào tuổi, vào vị trí ung thư, vào giới tính giữa nam và nữ, giữa ung thư trực tràng và đại tràng (p>0,05).. - Đa ̃ xác đi ̣nh được 5 đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 và vùng promoter dự đoán có vị trí tương ứng nằm trong đảo CpG số 4, đã nhân lên được đoạn ADN tương ứng với vùng promoter đã dự đoán.. - CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng là 80% ở mô u, và 37,5% ở mô lân cận u. - Sự sai khác về tỷ lệ methyl hóa ở 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). - Tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng của bệnh như tuổi, giới tính, vị trí ung thư và các giai đoạn bệnh theo TNM (p>. - Phạm Thu Huyền, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích tình trạng Methyl hóa Promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, Tạp chí y học Việt Nam tập 384(2), tr. - Ứng dụng kỹ thuật PCR- SSCP để phát hiện các đột biến ở gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền”, Tạp chí khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội số 27(2), tr 315.. - (2000), “MethyLight: a high-throughput assay to measure ADN methylation”, Nucleic Acids Research, 28(8), pp.32. - (2010), “CXCL12/ CXCR4 / CXCR7 chemokine axis and cancer progression”, Cancer Metastasis Review, pp.269-270. - 28.http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/page2#keypoint9 (11/2011)