- PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ITS CỦA RẦY NÂU (Nilaparvata lugens STAL.) Ở TỈNH ĐỒNG THÁP, VĨNH LONG, CẦN THƠ VÀ HẬU GIANG. - 2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. - Hình thái, Nilaparvata lugens, rầy nâu, trình tự ITS. - Đề tài được thực hiện nhằm so sánh đặc điểm hình thái của các chủng rầy nâu ở các vùng sinh thái khác nhau, đồng thời so sánh trình tự vùng ITS trong bộ gen của các chủng. - Kết quả cho thấy không có khác biệt hình thái giữa các quần thể rầy nâu thu ở bốn tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và Hậu Giang và cũng không có sự khác biệt khi so sánh với mô tả của các nghiên cứu trước. - Mười bốn chuỗi nucleotide sau khi giải trình tự được kiểm tra và phân tích bằng phần mềm Bio-Edit phiên bản 7.0. - Kết quả được giản đồ với chỉ số CI (Consistency Index). - Phân tích đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS của rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) ở tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và Hậu Giang. - Rầy nâu là mối hiểm họa đối với nghề trồng lúa ở Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng. - Vì vậy, nhiều nhà khoa học cho rằng việc gia tăng độc tính của rầy nâu có liên quan đến trồng lúa cải tiến ngắn ngày.. - Khi giống lúa kháng rầy IR26 ra đời, người ta nghĩ rằng vấn đề rầy nâu sẽ được giải quyết đơn giản.. - Nhưng chỉ sau vài năm sử dụng rộng rãi ở Indonesia và Philippines, giống IR26 đã nhiễm biotype mới của rầy nâu (Brady, 1979).. - Trong một vài năm gần đây, rầy nâu đã được kiểm soát ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nhờ vào việc áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp (IPM - Integrated pest management) rộng khắp, trong đó có sử dụng giống lúa kháng rầy nên rất hữu hiệu để khống chế mật số rầy nâu. - không mang gen kháng rầy và được trồng rải rác trong các vùng thâm canh nên mật số rầy nâu tăng cao và lây lan sang các giống lúa cao sản khác.. - Hiện nay, rầy nâu vẫn đang hiện diện trên ruộng lúa với các dạng hình sinh học (biotype) nguy hiểm gồm biotype 1 và 3 (Lưu Văn Quỳnh và ctv., 2010).. - Vì vậy, giả thuyết đặt ra là có thể có nhiều chủng rầy nâu mới có khả năng tấn công cả giống lúa kháng rầy. - Để giải thích cơ chế rầy nâu kháng lại các giống lúa kháng, cơ chế kháng thuốc trừ sâu và cơ chế. - truyền virus, việc nghiên cứu bộ gen rầy nâu là một công cụ rất mạnh mẽ và hữu ích. - Trong hầu hết các nghiên cứu phân tử về mối liên hệ giữa sinh vật với sinh vật hay sự tương tác giữa sinh vật với môi trường tự nhiên thường dựa trên việc phân tích trình tự vùng ITS (internal transcribed spacer) và đặc biệt hữu dụng trong phương pháp phân tử để phân loại sinh vật ở mức độ loài và thậm chí trong cùng một loài để xác định các chủng ở các vị trí địa lý khác nhau (Horton and Bruns, 2001). - Trình tự vùng ITS sẽ góp phần vào nghiên cứu bộ gen rầy nâu, dự kiến rất hữu ích trong việc xây dựng hệ thống quản lý rầy hiệu quả và bền vững hơn (Noda, 2009). - Từ các cơ sở trên đề tài “Phân tích trình tự ITS của rầy nâu (Nilaparvata lugens. - Stal) tại bốn tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang” được thực hiện với mục tiêu xác định sự đa dạng trình tự vùng ITS (bao gồm vùng ITS1, 5.8S và ITS2), từ đó giúp xác định các chủng rầy nâu hiện có ở bốn tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Hậu Giang và Cần Thơ.. - Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.. - Rầy nâu: thu 36 mẫu rầy nâu, trong đó: 18 mẫu ký hiệu từ 1 – 18 (vụ Đông Xuân mẫu ký hiệu từ 19 - 36 (vụ Hè Thu – 2016. - Rầy nâu bắt được cho vào keo nhựa có khoan lỗ trên nắp.. - Bảng 1: Danh sách mẫu rầy nâu vụ Đông xuân và vụ Hè Thu. - Vụ Đông Xuân Vụ Hè Thu. - 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Quan sát các đặc điểm hình thái Quan sát hình thái, chụp hình và ghi nhận các đặc điểm của rầy nâu tại phòng thí nghiệm theo các đặc điểm sau (Mochida và Okada, 1979):. - 2.4.2 Theo dõi mật số rầy nâu vào bẫy đèn ở Cần Thơ. - Bẫy đèn được treo ở sân Viện Nghiên cứu &. - Thu mẫu rầy nâu vào bẫy đèn mỗi đêm. - 2.4.3 Giải trình tự DNA vùng ITS. - Trích DNA: Sử dụng phần thân trên của rầy nâu để trích DNA theo quy trình của Rogers and Bendich (1988).. - Kiểm tra DNA: DNA của rầy sau khi trích được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0.8%.. - Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR Các mẫu DNA của rầy nâu sau khi ly trích và được điện di để kiểm tra chất lượng và độ tinh sạch của DNA được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR.. - Trình tự cặp primer: ITS1 5’–TCC GTA GGT GAA CCT GCG G–3’. - Giải trình tự vùng ITS được khuếch đại: Giải trình tự được thực hiện bằng máy ABI 3130 và được phân tích sơ bộ với phần mềm Sequencing Analysis 3.0.. - Phân tích và xử lý số liệu: Các trình tự được kiểm tra độ nhiễu và lỗi bằng phần mềm BioEdit 7.0. - M: số lượng nhỏ nhất có thể có của sự thay đổi tính trạng (bậc) trong một cây phát sinh loài bất kỳ.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái rầy nâu. - lugens được mô tả trong Hình 2 và 3 dựa trên việc quan sát thực tế các mẫu rầy nâu thu được.. - Qua Hình 2 và 3, có thể mô tả sơ lược các đặc điểm hình thái của rầy nâu như sau:. - Hình 4: Rầy nâu cánh dài (A: con đực, B: con cái) và Rầy nâu cánh ngắn (C: con đực, B: con cái . - Hình 5: Các dạng cánh rầy nâu A) Dạng cánh dài. - (B) Dạng cánh ngắn Hình 4 và 5 mô tả dạng cánh lưỡng hình của rầy. - Mặc dù chưa rõ cơ chế điều tiết hormone này nhưng dựa trên các quan sát thực tế có thể sự tương quan giữa hàm lượng chất dinh dưỡng trong cây lúa nơi rầy nâu chích hút và nồng độ hormone JH . - giai đoạn làm từ đòng đến trổ thường được cung cấp nhiều chất dinh dưỡng và rầy nâu cánh ngắn hiện diện với mật số khá cao. - Các con rầy nâu cánh dài này sẽ di trú để tìm nguồn thức ăn mới. - Ấu trùng rầy nâu khi được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng sẽ tạo dạng cánh ngắn là chủ yếu và ngược lại. - Tất cả các quan sát trên phù hợp với nghiên cứu của Zhang (1983).. - Khi mật độ ấu trùng quá nhiều, hàm lượng chất dinh dưỡng cung cấp cho mỗi ấu trùng giảm đi, lúc đó dạng cánh dài sẽ chiếm ưu thế giúp rầy nâu có thể di trú tìm nguồn thức ăn khác. - Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Iwanaga and Tojo (1986).. - Tóm lại, nhân tố bên ngoài quyết định trực tiếp đến sự tạo dạng cánh ở rầy nâu có thể là hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cây lúa và nhân tố bên trong là JH hormone được tìm thấy ở giai đoạn ấu trùng.. - Trong các mẫu rầy thu được, không tìm thấy rầy nâu có đột biến mắt đỏ - Mochida (1970) tìm thấy. - Đây là gen lặn có thể liên quan đến việc tạo sắc tố đen ở mắt bị đột biến.. - Trong các mẫu rầy nâu thu được có sự khác nhau về màu sắc cơ thể. - Rầy nâu có màu nâu nhưng đôi khi chúng có màu từ hơi đen đến rất đen, thường xuất hiện ở rầy đực. - (1988) sự khác nhau về màu sắc này có thể liên quan đến việc tạo sắc tố melanin trong cơ thể rầy.. - Rầy nâu trải qua năm giai đoạn ấu trùng (Hình 6). - Hình 6: Năm giai đoạn ấu trùng của rầy nâu (từ 1 đến 5 ngày tuổi . - Hình 7: Vỏ còn lại của rầy nâu sau khi lột xác . - Như vậy, các đặc điểm về hình thái của rầy nâu về cơ bản không khác so với mô tả của Mochida và Okada (1979). - (1984) và Bahagiawati and Rijzaani (2005), việc xác định các biotype rầy nâu không quan trọng bằng sự đa dạng nguồn gen giữa các cá thể trong một quần thể hay giữa các quần thể địa lý khác nhau và không có sự khác biệt về hình thái giữa các biotype.. - 3.2 Kết quả mật số rầy nâu vào bẫy đèn ở Cần Thơ. - Bẫy đèn là một dụng cụ khá đơn giản dùng để thu hút rầy nâu và một số loại sâu hại khác dựa vào đặc tính sinh học (tính hướng sáng) của một số loài côn trùng. - Đa số rầy nâu vào đèn là rầy trưởng thành cánh dài.. - Dựa trên các số liệu tính tổng rầy nâu vào đèn theo từng tháng, có biểu đồ sau Hình 8.. - Biểu đồ Hình 8 cho thấy mật số rầy nâu từ tháng 1 đến tháng 5 không cao và cũng không biến động nhiều. - Qua thực tế thu mẫu, số lượng rầy trên một bụi ít khoảng 5 – 7 con, có thể do các nguyên nhân sau:. - Đa phần nông dân tiến hành gieo sạ theo lịch của Trung tâm Khuyến nông thường là sau đợt rầy nâu di trú từ 2 – 3 ngày. - Rõ ràng với cùng số lượng rầy nâu nhưng khi được dàn trải trên một diện tích lớn thì mật độ rầy trên bụi sẽ giảm đi đáng kể.. - Bón phân và phun xịt thuốc diệt trừ rầy nâu hiệu quả.. - Hình 8: Biểu đồ rầy nâu vào bẫy đèn ở Cần Thơ từ tháng 1 đến tháng 6 Tuy nhiên, diễn biến mật số rầy nâu vào đèn. - Nguyên nhân có thể do đây là thời gian thu hoạch tập trung lúa hè thu nên rầy di trú rất nhiều. - Một nguyên nhân khác là nông dân chỉ chú trọng phòng trừ rầy nâu trong giai đoạn cây lúa từ khoảng 20 ngày đến khi trổ. - Nhưng rầy có thể quay lại cư trú trên cây lúa trong giai đoạn chín, khi đó ruộng được cung cấp đầy đủ nước, lá lúa nhiều đan xen lẫn nhau, đôi khi cây lúa bị ngã đổ, điều này sẽ tạo tiểu môi trường thích hợp cho sự phát triển của rầy nâu. - Theo Nguyễn Văn Liêm (2010) rầy nâu di trú khi chưa đẻ trứng, sau khi ăn 24 giờ buồng trứng mới phát triển, đến 48 giờ sau buồng trứng hoàn thiện và có thể sinh sản. - Rầy nâu di trú khi nguồn thức ăn giảm, vì vậy nếu tiến hành gieo sạ và thu hoạch đồng loạt rầy sẽ không tìm được nguồn thức ăn mới và không xảy ra. - Dựa trên thông tin mật số rầy nâu vào bẫy đèn có thể giúp theo dõi, dự báo tình hình phát sinh, phát triển của các lứa rầy nâu trên đồng ruộng, từ đó xác định được lịch thời vụ thích hợp để khuyến cáo cho người nông dân.. - 3.3 Kết quả phân tích trình tự vùng ITS Trích DNA. - Ban đầu, chân rầy nâu được sử dụng tách chiết DNA để tránh nhiễm DNA lạ, vì trong tuyến nước bọt và trong ruột của rầy nâu có nhiều sinh vật cộng sinh. - (2010) cũng sử dụng phần ngực hay chân rầy nâu để trích DNA.. - Xác định các chủng rầy nâu. - Long, Hậu Giang và hai mẫu (37, 44) đại diện cho mật số rầy nâu vào bẫy đèn ở Cần Thơ để giải trình tự.. - Hình 10: Mối quan hệ di truyền chủng loại của 14 mẫu rầy nâu. - Các chủng rầy nâu phân tích chia làm 4 nhánh chính:. - Ngoại trừ hai mẫu 37CT11 và 44CT6 là mẫu rầy nâu vào bẫy đèn nên khó xác định nguồn gốc chính xác (do rầy nâu có đặc tính di trú cao), sáu mẫu còn lại tuy được thu ở hai tỉnh khác nhau nhưng có điều kiện thổ nhưỡng khá tương đồng (ba mẫu thu ở vùng Đồng Tháp Mười - đất nhiễm phèn nặng, hệ thống thủy lợi có nhiều kênh để xả phèn và ba mẫu thu ở hai huyện Vị Thủy và Vị Thanh - đất nhiễm phèn nhẹ, nông dân bón tro để trung hòa độ acid trong đất) nên có thể hiểu được tại sao các mẫu này được xếp cùng một nhóm.. - Tuy nhiên, với giả định hai quần thể rầy nâu trên có nguồn gốc khác nhau. - Kết quả nghiên cứu này khá phù hợp với nghiên cứu của Jones et al. - Ban đầu, nhóm tác giả này đã dựa vào trình tự vùng 18S để xây dựng cây phát sinh loài của các quần thể Nilaparvata lugens sống trên lúa và trên cỏ Leersia hexandra (Schwartz) ở Ấn Độ, Đông Nam Á, Nhật và Australia. - Nhưng do có rất ít sự khác biệt trong trình tự gen 18S nên họ đã chọn vùng trình tự ITS để tiếp tục nghiên cứu. - Kết quả cho thấy có sự khác biệt lớn trong trình tự ITS giữa các quần thể Châu Á và Australia hơn là khác biệt giữa các quần thể trên cây lúa và Leersia. - Họ cho rằng hai quần thể rầy nâu trên cây lúa và trên Leersia chỉ là một loài. - Tuy không khẳng định đây là hai chủng khác nhau nhưng rõ ràng điều kiện địa lý khác biệt đã làm thay đổi trình tự vùng ITS, cơ sở phát sinh chủng mới trong cùng một loài.. - Như vậy, ở một ngưỡng nào đó, điều kiện thổ nhưỡng có thể đã tác động đến trình tự gen vùng ITS dẫn đến có sự phân nhóm giữa các mẫu. - Nhưng những khác biệt này chưa thể hiện rõ, chưa đủ để gây biến đổi chủng rầy nâu hiện hành.. - Dựa vào kết quả khảo sát hình thái và phân tích trình tự vùng ITS của rầy nâu cho thấy không có khác biệt hình thái giữa các quần thể rầy nâu thu ở bốn tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và Hậu Giang. - Như vậy, điều kiện sống khác nhau giữa các vùng trồng lúa có thể đã ảnh hưởng đến trình tự vùng ITS nhưng chưa đủ để gây biến đổi chủng rầy nâu.. - Kết quả thanh lọc rầy nâu bộ giống lúa miền Trung. - Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ 2006-2010. - Diễn biến số lượng rầy nâu vào đèn và những vấn đề cần quan tâm cho vụ lúa Thu Đông, Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Vĩnh Long.