- Pseudomonas stutzeri dòng E1 có khả năng di chuyển bề mặt tăng gấp đôi khi nuôi trong môi trường tối thiểu được phủ phenanthrene. - Thí nghiệm mao dẫn cũng cho thấy E1 di chuyển nhanh gấp năm lần về hướng có phenanthrene. - Plasposon pTnMod-OGm được dùng để tạo thư viện đột biến dòng E1. - Trong số 2639 đột biến đã khảo sát, 82 đột biến biểu hiện những thay đổi về khả năng di chuyển theo phenanthrene và/hoặc phân hủy phenanthrene. - 16 đột biến được chọn để giải trình tự của các gen đột biến tương ứng. - Đột biến gen flhA làm E1 mất khả năng bơi và di chuyển bề mặt, đột biến gen flgK làm mất khả năng bơi và giảm khả năng di chuyển bề mặt của E1. - Đột biến gen cheY làm mất khả năng bơi và giảm khả năng di chuyển bề mặt trong khi đột biến gen gidA làm giảm khả năng phân hủy phenanthrene và giảm cả khả năng bơi và di chuyển bề mặt của E1. - Đột biến gen tổng hợp protein Zn-dependent protease và gen tổng hợp vỏ polysaccharide làm cho E1 mất khả năng di chuyển bề mặt chứng tỏ các protein này cũng giữ vai trò tiềm năng trong hoạt động di chuyển bề mặt của P. - Từ khoá: Pseudomonas stutzeri , hydrocarbon đa vòng thơm, phenanthrene, hóa hướng động, plasposon pTnMod-OGm, bơi, di chuyển bề mặt. - Nhiều PAHs và các dạng oxi hóa của chúng rất độc có thể gây đột biến và ung thư (Samata et al., 2002). - Trong đất, vi sinh vật có vai trò chính trong quá trình phân hủy PAHs (Bastiaens et al., 2000). - Vi khuẩn Pseudomonas, Sphingomonas và Mycobacterium được xem là những vi sinh vật phân hủy PAHs quan trọng nhất trong đất bị ô nhiễm (Uyttebroek, 2005). - Tuy nhiên, PAHs lưu tồn trong hệ sinh thái do chúng ít tan trong nước và bám vào các phân tử chất rắn làm cho vi sinh vật rất khó tiếp xúc và phân hủy (Habe &. - Khả năng di chuyển theo các chất ô nhiễm (hóa hướng động) có lẽ là một đặc tính thuận lợi của các vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất này. - Hóa hướng động giúp vi sinh vật có thể phát hiện và di chuyển về các nguồn ô nhiễm trong đất (Grimm &. - Thật vậy, các vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ khác nhau cũng thể hiện khả năng hóa hướng động theo các chất ô nhiễm như hydrocarbon một vòng và đa vòng, alkan, nitroaromatics, và các thuốc trừ sâu gốc chlor (Pandey &. - Các nghiên cứu hiện nay cho thấy các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy PAHs như P. - Sniegowski, 2005) cũng thể hiện khả năng hóa hướng động với phenanthrene. - Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát cơ chế di truyền của khả năng hóa hướng động theo phenanthrene ở P. - stutzeri E1 bằng cách sử dụng plasposon pTnMod- OGm để tạo thư viện đột biến. - Các đột biến sau đó được chọn lọc bao gồm các dạng bị ảnh hưởng khả năng bơi và/hoặc di chuyển bề mặt, và/hoặc phân hủy phenanthrene. - Một số đột biến đại diện về các kiểu hình trên được giải trình tự để xác định các gen liên quan đến các chức năng này.. - stutzeri E1 đã được phân lập từ đất bị ô nhiễm PAHs có khả năng di chuyển theo phenanthrene (Bijdekerke, 2004. - Plasposon là một mini-Tn5 transposon có sửa đổi và được dùng để gây đột biến ở vi khuẩn Gram âm (Dennis &. - Đặc trưng của plasposon là chúng được thiết kế để có thể phục hồi kiểu hình đột biến và giải trình tự ADN ở hai phía plasposon đã chèn vào (Leveau et al., 2006). - Zylstra, 1998) (Hình 1) được biến nạp vào tế bào cảm biến của E1 để tạo thư viện đột biến.. - 2.2 Tạo thư viện đột biến bằng plasposon 2.2.1 Biến nạp bằng điện (Electrotransformation). - ADN genome của 10 đột biến ngẫu nhiên và dạng hoang dại được ly trích bằng Puregene DNA Purification Kit, Gentra và sau đó lai bằng phương pháp Southern Blot để kiểm tra sự biến nạp ngẫu nhiên của plasposon vào E1.. - 2.2.2 Chọn lọc đột biến. - Các đột biến được nuôi trong môi trường TSA (TSB có agar) được phủ 0.2%. - phenanthrene để cảm ứng khả năng phân hủy và hóa hướng động với phenanthrene. - Các microtiter plate 12 giếng (Greiner Bio-one) được sử dụng để chọn lọc các đột biến bị ảnh hưởng khả năng di chuyển theo và phân hủy phenanthrene. - Các đột biến đại diện được nuôi cấy và khẳng định kiểu hình trong các dĩa Petri. - Khả năng phân hủy phenanthrene của các đột biến này cũng được theo dõi khi nuôi trên môi trường tối thiểu có bổ sung phenanthrene.. - Trình tự gen của các đột biến ở hai phía nơi plasposon đã gắn vào được phân tích nhờ các primer Rhi-721 và Rhi-722 (Dennis &. - ADN genome của các đột biến được trích và chuẩn bị theo ABI PRISM BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Applera). - 3.1 Tạo thư viện đột biến bằng plasposon ở P. - Kết quả phân tích Southern blot cho thấy TnMod-OGm đã gắn ngẫu nhiên vào các vị trí khác nhau trên ADN của từng đột biến (Hình 2).. - Hình 2: Phân tích Southern blot của 10 đột biến ngẫu nhiên (1-10), wild type: hoang dại. - 3.2 Chọn lọc đột biến. - 82 trong số 2639 đột biến được khảo sát trong các microtiter plate 12 giếng cho thấy có sự thay đổi về khả năng hóa hướng động với và/hoặc phân hủy phenanthrene. - Tùy vào cách di chuyển, bơi trong agar hoặc di chuyển bề mặt và phân hủy phenanthrene, các đột biến được xếp vào các nhóm: tăng, giảm hoặc mất khả năng di chuyển bề mặt và/hoặc bơi, và giảm khả năng phân hủy phenanthrene so với dạng hoang dại (Bảng 1).. - stutzeri E1 có khả năng di chuyển bề mặt nhanh gấp đôi khi nuôi trong môi trường tối thiểu có phủ phenanthrene so với đối chứng, thí nghiệm mao dẫn cũng chứng minh E1 di chuyển về hướng có phenanthrene hòa tan nhanh gấp năm lần so với đối chứng (Fredslund, trao đổi cá nhân). - Ở nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy ngay cả trong môi trường giàu dinh dưỡng như TSA có phủ phenanthrene, E1 vẫn thể hiện khả năng di chuyển bề mặt theo phenanthrene. - Kết quả quan sát cho thấy E1 có hai hình thức di chuyển: bơi trong agar và di chuyển trên bề mặt agar, đồng thời di chuyển theo phenanthrene là đặc tính vốn có của P. - Các đột biến bị mất khả năng bơi sẽ ảnh hưởng đến hoạt động di chuyển bề mặt.. - Các đột biến mất khả năng bơi sẽ giảm hoặc mất hẳn khả năng di chuyển bề mặt như đột biến 25A8, 5A10 và 19A7. - coli và Samonella typhimurium, phức hệ chiên mao dùng cho hoạt động bơi và khả năng hóa hướng động rất cần thiết cho hoạt động di chuyển bề mặt (Harshey &. - Hơn nữa, đột biến 5H5 bị giảm khả năng bơi cũng mất khả năng di chuyển bề mặt. - Tuy nhiên ở các đột biến 11C3 và 28E9, khả năng di chuyển bề mặt không bị ảnh. - hưởng khi khả năng bơi giảm. - Như vậy, hoạt động bơi và di chuyển bề mặt theo phenanthrene ở E1 dường như có liên quan với nhau ở chừng mực nào đó.. - Bảng 1: Kiểu hình của các đột biến đại diện khi nuôi cấy trong các microtiter plate 12 giếng với môi trường TSA (0.3% agar) có phủ phenanthrene. - Vị trí trên microtiter plate Kí hiệu Khả năng Di chuyển Phân hủy. - Dĩa Giếng đột biến bơi bề mặt phenanthrene. - tăng khả năng bơi hoặc di chuyển bề mặt. - giảm khả năng bơi, di chuyển bề mặt hoặc phân hủy phenanthrene. - mất khả năng bơi hoặc di chuyển bề mặt wt: kiểu hình hoang dại. - Hình 3: Kiểu hình của các đột biến đại diện của E1 bị ảnh hưởng khả năng di chuyển theo phenanthrene so với dạng hoang dại. - 20C11: giảm khả năng di chuyển bề mặt, C. - 5A10: mất khả năng bơi và giảm khả năng di chuyển bề mặt, D. - 5H5: giảm khả năng bơi và mất khả năng di chuyển bề mặt.. - Hình 4: Kiểu hình của các đột biến đại diện của E1 bị ảnh hưởng khả năng di chuyển theo và phân hủy phenanthrene so với dạng hoang dại. - 13H10: tăng khả năng bơi, C và D. - 11C3 và 28E9: giảm khả năng bơi, E và F. - mất khả năng di chuyển bề mặt, G. - 19A7: mất khả năng bơi và di chuyển bề mặt, H. - 24G8: giảm khả năng phân hủy phenanthrene và giảm khả năng bơi và di chuyển bề mặt. - Mặt khác, giảm hoặc mất khả năng di chuyển bề mặt không phải luôn luôn ảnh hưởng đến khả năng bơi. - Các đột biến 20C11, 24A8, 13B4, 19H9, 20E1 và 20F10 bị giảm hoặc mất khả năng di chuyển bề mặt trong khi khả năng bơi không bị ảnh hưởng. - Do vậy, các gen liên quan đến khả năng di chuyển bề mặt theo phenanthrene có lẽ ít nhiều khác với các gen tham gia vào hoạt động bơi ở E1.. - Khả năng di chuyển theo và phân hủy phenanthrene của P. - Đột biến 24G8 giảm khả năng phân hủy phenanthrene cũng giảm khả năng bơi và di chuyển bề mặt. - Tương tự, đột biến 22H9 giảm khả năng phân hủy phenanthrene cũng mất khả năng di chuyển bề mặt.. - Trình tự ADN ở các đột biến đại diện của P. - Hầu hết các đột biến có cùng kiểu hình mang plasposon ở các gen giải mã cho các protein không giống nhau (Bảng 2). - Phần lớn các protein không liên quan trực tiếp đến khả năng di chuyển của vi khuẩn, chẳng hạn như two-component response regulator ở đột biến 13H10, AMP-binding enzyme ở đột biến 20C11, secreted protein containing DUF 541 ở đột biến 24A8, SbcC ở đột biến 3F7, prefoldin ở đột biến 19H9, FAD-dependent oxidoreductase ở đột biến 20E1, PA4523 ở đột biến 20F10, probable outer membrane protein precursor ở đột biến 11C3, allantoicase ở đột biến 28E9 và TrmH ở đột biến 5H5 (Bảng 2).. - Tuy nhiên, trong vài trường hợp, dựa theo tài liệu, một số giả thuyết có thể đặt ra để giải thích mối liên quan của các protein này với khả năng bơi và di chuyển bề mặt của P. - Sự bất hoạt về khả năng di chuyển bề mặt ở đột biến 5G11 là do TnMod-OGm chèn vào gen tổng hợp Zn-dependent protease, enzyme có chức năng cuộn protein với đầu N có trình tự giống với heat-shock protein HtpX ở vi khuẩn. - Ở Myxococcus xanthus, protein tương tự HtpX cũng liên quan đến khả năng di chuyển bề mặt (Yang et al., 1998). - Đột biến 13B4 bị mất khả năng di chuyển bề mặt do đột biến xảy ra ở gen giải mã cho capsular polysaccharide biosynthesis protein (CPS). - mirabilis, CPS đóng vai trò quan trọng trong hoạt động di chuyển bề mặt do chúng làm trơn bề mặt môi trường. - Các đột biến không có lớp polysaccharide có khả năng di chuyển giảm (Gygi et al., 1995). - Điều này cho thấy, ngoài chiên mao lớp polysaccharide cũng có chức năng trong hoạt động di chuyển bề mặt của E1. - Gen flhA bị bất hoạt làm cho đột biến 19A7 mất cả khả năng bơi và di chuyển bề mặt. - Thật vậy, flhA ở Bacillus thuringiensis bị đột biến làm cho chúng không thể tổng hợp chiên mao và do vậy mất khả năng di chuyển (Ghelardi et al., 2002). - Mặc khác, đột biến 5A10 mang gen flgK đột biến nên mất khả năng bơi và giảm khả năng di chuyển bề mặt. - Các kết quả này cho thấy hoạt động bơi và di chuyển bề mặt có liên hệ nhau và cả hai đều do chiên mao điều khiển.. - Do vậy, sự di chuyển bề mặt của E1 cũng là quá trình do chiên mao kiểm soát.. - Đột biến 25A8 mang gen cheY bất hoạt làm mất khả năng bơi và giảm khả năng di chuyển bề mặt. - aeruginosa bị đột biến, chúng vẫn di chuyển nhưng mất khả năng di chuyển bề mặt đồng thời mất khả năng hóa hướng động đối với peptone, methyl thiocyanate và phosphate (Masduki et al., 1995). - Đột biến ở gen gidA làm cho đột biến 24G8 giảm khả năng phân hủy phenanthrene, bơi và di chuyển bề mặt. - Thật vậy, đột biến gidA ảnh hưởng đến nhiều tính trạng như tổng hợp kháng sinh, di chuyển bề mặt. - Tạo đột biến bằng plasposon ở P. - stutzeri E1 giúp xác định vài loại protein có lẽ liên quan đến khả năng di chuyển theo phenanthrene của E1 như Zn-dependent protease with chaperone function, capsular polysaccharide biosynthesis protein, FlhA, FlgK, CheY và GidA. - Bảng 2: Kết quả BlastX của 16 đột biến đại diện bị ảnh hưởng khả năng di chuyển theo và phân hủy phenanthrene. - Đột biến Kiểu hình Tương đồng Identity Genbank. - Bơi Di chuyển bề mặt. - Phân hủy phenan- threne. - mất khả năng bơi hoặc di chuyển bề mặt