- PHÁT HIỆN QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN TRONG PHÂN TỬ PROTEIN AS16 CỦA ASCARIS SUUM, ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮC-XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH GIUN ĐŨA Ở HEO. - Vaccinal effects of recombinant protein AS16 were analyzed in experimental mice BALB/c. - The results of this study showed that major epitope of protein AS16 predictably locates within 30G - 60A region and mice intranasally vaccinated with Escherichia coli-expressed recombinant AS16, generated a significant increase in the level of rAS16-specific antibody responses. - Trong những năm gần đây, vắc-xin tái tổ hợp được đánh giá như là một trong những phương pháp phòng chống bệnh hiệu quả cho vật nuôi, trong đó có bệnh giun đũa ở heo. - Một số nghiên cứu đã chứng minh, protein 16- kilodalton (AS16) được phát hiện từ ấu trùng và giun đũa trưởng thành có khả năng tạo phản ứng miễn dịch trên chuột và heo. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến phân tích các đặc điểm về tính kỵ nước và ưa nước của phân tử protein AS16 dựa trên phần mềm Genetyx phiên bản 10.0 để dự đoán vị trí quyết định kháng nguyên trong phân đoạn này và tiến hành đánh giá hiệu quả miễn dịch của phân tử protein tái tổ hợp AS16 được tiêm chủng ở chuột thí nghiệm BALB/c. - Kết quả cho thấy, quyết định kháng nguyên của phân tử protein AS16 được dự đoán định vị tại vị trí 30G - 60A, chuột được tiêm với phân tử protein tái tổ hợp AS16 với GST được biểu hiện qua Escherichia coli BL21, đã tạo phản ứng miễn dịch ý nghĩa trên chuột. - Những kết quả thu được sẽ là nội dung tham khảo quan trọng trong việc sản xuất vắc-xin tái tổ hợp dựa trên quyết định kháng nguyên 30G - 60A để phòng bệnh giun đũa ở heo.. - Giun đũa A. - Nhiều nghiên cứu đã cho thấy hai loài này có đặc điểm sinh học gần nhau như về di truyền, tính sinh miễn dịch và đặc điểm gây bệnh. - Mặc dù có nhiều loại kháng nguyên đã được nghiên cứu trong việc phòng bệnh giun đũa được thực hiện ở phòng thí nghiệm, tuy nhiên những kháng nguyên này mang tính tương đồng với protein của vật chủ, điều này có thể gây ra sự không hiệu quả trong quá trình tạo miễn dịch khi được tiêm phòng. - Khả năng sinh miễn dịch của AS16 được xác định trên chuột thí nghiệm và kháng thể sinh ra từ kháng nguyên này giúp giảm số lượng ấu trùng xuất hiện ở chuột gây nhiễm (Tsuji et al., 2003). - Từ những lý do trên, phân tử protein AS16 được lựa chọn để biểu hiện qua phương pháp tổng hợp protein tái tổ hợp nhằm phục vụ cho sản xuất thương mại. - Các đặc điểm về kháng nguyên protein AS16 và hiệu quả tạo miễn dịch của vắc-xin tái tổ hợp này được xác định. - Kết quả nghiên cứu có thể thông tin quan trọng cho việc sản xuất vacine tái tổ hợp phòng chống bệnh giun đũa ở heo cũng như ở người.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Bộ kit dung hợp DNA Ver2.1 (Takara Bio INC, Japan), enzyme cắt giới hạn EcoRI, XhoI (Takara, Nhật Bản), bộ kit phản ứng PCR (Toyobo, Nhật Bản), bộ kit ly trích DNA Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, USA), chủng E.coli BL21 biểu hiện (In vitrogen, Carlsbad CA, USA), bộ kit ly trích protein tái tổ hợp affinity matrix Glutathione Sepharose® 4B (GE Healthcare, Uppsala, Sweden), kháng thể đối chứng dương AS16 (Viện Thú y Quốc gia Nhật Bản), kháng thể đối chứng âm được lấy chuột sạch bệnh, kháng thể thứ hai được lấy tử kháng huyết thanh thỏ (rabit antimouse IgG antibodies) (Benthyl, Delta West, Australia) được sử dụng trong ELISA và Western blot, TMB peroxidase (KPL Inc, Maryland, USA).. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu. - Phân tích đặc điểm hóa học dựa trên phần mềm Gene mã hóa protein AS16 từ A. - Phần mềm Genetyx 10.0- Win DNA (Software Inc, Tokyo, Japan) được sử dụng để phân tích các đặc điểm hóa học, trình tự mã hóa cho phân tử protein. - Trọng lượng phân tử, đặc điểm kỵ nước và ưa nước, điểm đẳng điện pI (isoelectric point) cũng được xác định.. - Phản ứng PCR khuếch đại DNA. - Chuẩn bị dung hợp vào pGex-5X3 vector: Để chuẩn bị nhân dòng gene đích AS16 vào vector biểu hiện pGex-5X3 (GE Healthcare, Uppsala,. - Chuỗi trình tự DNA của AS16 được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng bộ cặp mồi được thiết kế bởi phòng thí nghiệm Laboratory of Global Animal Resources Science.. - Cả hai sản phẩm PCR và vector biểu hiện pGex-5X3 được cắt bởi hai enzyme cắt giới hạn trên. - Chuẩn bị dung hợp pColdI vector: Quy trình dung hợp AS16 vào vector biểu hiện pColdI được thực hiện tương tự như mô tả trên.. - Sản xuất protein tái tổ hợp (AS16_GST) Protein tái tổ hợp AS16 dung hợp với GST (Glutathione S transferase) và His-tagged (Histidine tagged) được tổng hợp trên vi khuẩn E.. - Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất của mỗi loại vector biểu hiện.. - Nhóm thứ nhất, mỗi chuột được tiêm 50 μg protein tái tổ hợp AS16_GST kết hợp với tá dược Freund’s Complete Adjuvant (FCA, DIFCO, Detroit, MI, USA) với thể tích 200 μl. - Huyết thanh cuối cùng được thu thập sau 2 tuần từ lần tiêm chủng thứ ba để kiểm tra phản ứng miễn dịch. - Hiệu giá kháng thể được xác định bằng độ hấp phụ trung bình ± SD.. - 2.3 Phản ứng ELISA và phản ứng Western blot Để xác định tính sinh miễn dịch của phân tử protein, phản ứng ELISA và Western blot được sử dụng.. - Phản ứng ELISA. - Đĩa nhựa 96 giếng (Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) được phủ với 25 ng cho mỗi giếng trong 50 μl protein tái tổ hợp rAS16_His được pha với bicarbonate buffer 0,1M và ủ ở 4 o C trong 12h. - Phản ứng được kết thúc với 50 μl 1M H2SO4. - Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong ELISA được xác định bởi giá trị độ mật quang ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc VERSA max microplate reader (Molecular devices, California, USA).. - Phản ứng Western blot. - 0,01 μg protein tái tổ hợp AS16 với GST được sử dụng trong điện di protein gel 15% SDS-PAGE, sau đó được chuyển sang màng lọc PVDF Immobilon-P kích thước 0,45 µm (Millipore, MA, USA), tiếp theo màng lọc được ủ với huyết thanh kháng protein tái tổ hợp AS16_His (kháng thể thứ nhất). - 2.4 Phân tích thống kê. - Hiệu giá kháng thể trong phản ứng ELISA được xác định bằng giá trị OD450 nm. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân tích đặc điểm kháng nguyên của AS16 bằng phần mềm Genetyx 10.0. - Phân tử protein AS16 được kết hợp từ 132 acid amin, không bao gồm peptide tín hiệu (signal peptide), được chia ra thành 5 đoạn peptide gồm khoảng 30 acid amin cho mỗi đoạn. - Sự phân chia này được thực hiện dựa trên tính toán các vùng kỵ nước và ưa nước trong phân tử protein AS16.. - Những đặc điểm kỵ nước và ưa nước này có thể liên quan trực tiếp đến đặc điểm kháng nguyên và. - tính sinh miễn dịch của phân tử protein AS16.. - Phân tích đặc điểm sinh hóa của protein được xác định dựa theo phương pháp của Hoop-Woods và được thực hiện trên phần mềm Genetyx 10.0. - Qua Hình 1 cho thấy, mức độ kỵ nước của phân tử protein AS16 được xác định trong vùng AS16.30- 60. - Dựa trên kết quả phân tích phần mềm, chúng ta có thể xác định đặc điểm sinh hóa và dự đoán vị trí quyết định kháng nguyên trước khi thực hiện các thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên này. - Theo Hopp and Woods, 1981 có thể dự đoán được vị trí của những quyết định kháng nguyên nằm vào những đoạn ưa nước trong một phân tử protein. - Do đó, từ phân tích những đặc điểm trên cho thấy những quyết định kháng nguyên quan trọng của phân tử protein AS16 có thể định vị tại các phân vùng AS16.30-60, AS16.90-121 và AS16.121-150.. - Hình 1: Đặc điểm ưa nước và kỵ nước của phân tử protein AS16. - Phân tích hóa học của phân tử protein được thực hiện trên phần mềm Genetyx 10.0. - Đặc điểm kỵ nước và ưa nước được xác định. - theo phương pháp Hoop-Woods 3.2 Biểu hiện và phân tích đặc điểm hóa. - học của protein tái tổ hợp AS16. - Để tránh phản ứng chéo từ trên cùng đoạn protein dung hợp, hai vector gồm pGex-5X3 và pColdI, hình thành nên lần lượt hai protein tái tổ hợp Glutathione S transferase (GST) và Histidine- tagged (His-tagged). - Đoạn gene mã hóa cho protein AS16 được tổng hợp bằng phản ứng PCR.. - Sản phẩm khuếch đại từ phản ứng PCR được chèn vào các vector biểu hiện trên. - Sự tổng hợp protein tái tổ hợp được thực hiện qua vi khuẩn E. - Protein tái tổ hợp trong GST head được tinh lọc bằng phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography). - Dịch chiết xuất từ tế bào E.coli được tinh lọc để có protein tái tổ hợp tinh khiết.. - Qua biểu hiện trên gel điện di SDS-PAGE, protein tái tổ hợp chiết xuất được xác định đạt độ tinh khiết là 99%.. - Vì trọng lượng phân tử của phần GST là 26kDa, do đó, tổng trọng lượng phân tử của protein tái tổ hợp AS16_GST là 40,50 kDa. - Tuy nhiên, trọng lượng phân tử quan sát được của protein tái tổ hợp rAS16 là 37,5 kDa. - Tương tự, protein AS16 cũng được tổng hợp từ vector biểu hiện pColdI ở 15 0 C và được chiết xuất bằng Ni-NTA agarose. - Protein mục tiêu được quan sát trên SDS-PAGE với trọng lượng phân tử là 18kDa.. - Sự khác biệt giữa trọng lượng phân tử lý thuyết và biểu hiện trên SDS-PAGE cũng được nhận biết trong biểu hiện protein tái tổ hợp với His-tagged.. - Theo lý thuyết, protein tái tổ hợp AS16_GST được cấu tạo từ 2 phân đoạn AS16 và GST do đó, sau khi thực hiện phản ứng phân cắt 2 phần này sẽ tách rời và được biểu hiện trên SDS-PAGE theo trọng lượng phân tử tương ứng lần lượt AS16:14,5kDa. - Tuy nhiên, qua phản ứng điện di protein, AS16 protein không được phát hiện trên SDS-PAGE sau khi sử dụng yếu tố Xa (Novagen, EMD Biosciences, Germany), trọng lượng của GST sau phản ứng cắt di chuyển cùng vị trí của GST tự do (kết quả không được công bố). - Điều này chứng tỏ, đặc điểm hóa học tự nhiên của đoạn protein AS16 này đã tạo nên sự di chuyển khác với kích thước lý thuyết.. - Hình 2: Biểu hiện protein tái tổ hợp AS16 với GST và Histidine-tagged trên điện di SDS-PAGE 15%. - Biểu hiện protein tái tổ hợp AS16 với GST. - Biểu hiện protein tái tổ hợp AS16 với Histidine tagged 3.3 Đánh giá tính trội miễn dịch. - (immunodominance) của protein tái tổ hợp AS16 bằng phương pháp ELISA và Western blot. - Đặc điểm kháng nguyên của protein tái tổ hợp AS16 được đánh giá qua phản ứng ELISA và Western blot. - Protein dung hợp với GST được chiết xuất sử dụng như là kháng nguyên trong phản ứng ELISA và được xác định bởi kháng thể đặc hiệu AS16 thu được từ chuột được tiêm với protein tái tổ hợp AS16 với His-tagged (rAS16_His) độ pha loãng 1:4.000. - Tín hiệu phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được đo bởi giá trị độ mật quang ở bước sóng 450 nm. - Qua Hình 3 cho thấy, không có phản ứng giữa kháng nguyên được sử dụng là GST tự do và kháng thể kháng rAS16_His.. - Điều này cho thấy không có phản ứng chéo giữa kháng thể kháng AS16_His và protein GST.. - Tính kháng nguyên của protein AS16 tiếp tục được phân tích bằng phản ứng Western blot.. - Protein tái tổ hợp với GST protein được đưa vào gel điện di SDS-PAGE, sau đó được chuyển sang màng lọc PVDF. - Phản ứng miễn dịch được biểu hiện bằng TMB substract. - Đặc điểm kháng nguyên được phân biệt qua độ đậm của vạch protein trên màng PVDF. - Kết quả cho thấy, protein AS16 được phát hiện bởi kháng thể rAS16_His, trong khi đó thì không có tín nào của phản ứng giữa GST tự do và kháng thể kháng rAS16_His. - Kết quả này giúp xác nhận cho kết quả phân tích từ ELISA.. - protein tái tổ hợp AS16 (kDa). - lane 2: protein tái tổ hợp AS16 (rAS16_His) (kDa). - Hình 3: Đánh giá tính trội miễn dịch của protein tái tổ hợp AS16 bằng phương pháp ELISA và Western blot. - So sánh tính trội miễn dịch giữa protein tái tổ hợp AS16_GST và GST tự do được sử dụng như kháng nguyên trong phản ứng ELISA (p<0,05). - Kết quả phân tích tính sinh miễn dịch được khẳng định bằng phản ứng Western blot. - 3.4 Đánh giá tính sinh miễn dịch. - Protein tái tổ hợp AS16_GST chiết xuất được phối hợp với tá dược. - FCA trong tiêm chủng để đạt miễn dịch tối ưu.. - Hiệu giá kháng thể của chuột tiêm phòng được xác định bằng phản ứng ELISA. - Qua kết quả cho thấy, chuột tiêm với AS16 có phản ứng miễn dịch đặc hiệu cao hơn so với nhóm chỉ tiêm tá dược FCA và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).. - Hình 4: Phản ứng miễn dịch của chuột được tiêm với rAS16_GST Hiệu giá được biểu hiện lũy thừa 2 (p<0,05). - Từ những phân tích đặc điểm hóa học của phân tử protein AS16 bằng phần mềm Genetyx 10.0, quyết định kháng nguyên chủ của yếu phân tử. - Điều này gợi ý cho những nghiên cứu sau này về việc sử dụng peptide 30G – 60A trong việc sản xuất protein tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả miễn dịch phòng chống bệnh giun đũa ở heo.. - Protein tái tổ hợp AS16 dung hợp với GST và His-tagged tương đồng với đặc điểm của protein AS16 tự nhiên và AS16_GST tạo phản ứng miễn dịch hiệu quả ở chuột thí nghiệm. - Điều này mang lại cho việc phòng chống bệnh giun đũa ở heo và người bằng protein tái tổ hợp.