- PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI. - PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) VÀ VIBRIO HARVEYI NHIỄM TRÊN TÔM NUÔI. - Developing an mPCR procedure for the detection of White spot syndrome virus (WSSV) and Vibrio harveyi in infected cultured shrimp Từ khóa:. - mPCR, Vibrio harveyi, WSSV và tôm. - The procedure is based on the one-step PCR protocol, in which: primers F6, R4 designed from vhh gene, a specific gene of Vibrio harveyi (Sun et al., 2009) and primers P1, P2, P3, P4 of WSSV (Kimura et al., 1996). - Thâm canh hóa nghề nuôi tôm cùng với sự tác động của biến đổi khí hậu dẫn đến tình hình dịch bệnh trên tôm diễn biến phức tạp và khó kiểm soát.. - Tác nhân gây bệnh chủ yếu do vi-rút và nhóm vi khuẩn thuộc giống Vibrio.. - Do đó, cần có những phương pháp chẩn đoán nhanh, tính đặc hiệu cao nhằm phát hiện sớm và đúng tác nhân gây bệnh. - Qui trình PCR đa mồi cho phép phát hiện đồng thời vi khuẩn gây bệnh phát sáng (Vibrio harveyi) và vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm nuôi. - Qui trình PCR đa mồi được thiết kế dựa trên các qui trình PCR đơn sử dụng: đoạn mồi F6, R4 thiết kế từ gen vhh, gen đặc trưng cho Vibrio harveyi (Sun et al., 2009) và đoạn mồi P1, P2, P3, P4 của WSSV (Kimura et al., 1996).. - Kết quả cho thấy tổng thời gian khuếch đại khoảng 3 giờ, với qui trình này có thể ứng dụng để phát hiện đồng thời vi-rút gây bệnh đốm trắng và vi khuẩn gây bệnh phát sáng trên tôm trong thời gian ngắn.. - Bệnh phát sáng là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng của nhiều đối tượng thủy sản, bệnh có thể lây lan và phát triển thành dịch. - Một số loài vi khuẩn. - có khả năng phát sáng như Vibrio harveyi, V.. - harveyi đã được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng trên tôm sú (Penaeus monodon) (Pass et al., 1987). - Ở Philippine công bố tác nhân gây bệnh. - phát sáng trên tôm là do Vibrio harveyi, V.. - harveyi chiếm ưu thế (Lavilla-Pitogo et al., 1990). - Bệnh có thể xuất hiện trên tất cả các giai đoạn ương nuôi từ trứng đến tôm trưởng thành. - Bệnh gây thiệt hại lớn ở giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng với tỉ lệ chết có thể lên đến 100%. - Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Đài Loan vào năm 1992 (Chou et al., 1995), sau đó lan rộng ra nhiều nước trên thế giới (Escobedo Bonilla et al., 2008). - Bệnh có thể gây chết tôm, với tỉ lệ chết 100% trong vòng 3-10 ngày (Lightner, 1996). - Hệ thần kinh chỉ nhiễm ở giai đoạn cuối (Marks et al., 2005). - Tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng bị nhiễm WSSV khi gây cảm nhiễm ở 25 o C trong vòng 20 giờ, WSSV có thể nhiễm mãn tính suốt đời vật chủ nếu như vật chủ khỏe mạnh và số lượng tác nhân gây bệnh không đáng kể (OIE, 2009).. - Phương pháp cho kết quả nhanh và đáng tin cậy. - Với đặc điểm gây bệnh có tỉ lệ chết cao, dễ lây lan và khó kiểm soát của bệnh đốm trắng và bệnh phát sáng, cần có qui trình giúp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân gây ra các bệnh này trên tôm nuôi. - Do vậy, nghiên cứu phát triển qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi trên tôm nuôi là cần thiết nhằm rút ngắn thời gian phân tích và vẫn giữ khả năng phát hiện bệnh với độ chính xác cao.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu. - Ly trích DNA của Vibrio harveyi: Nuôi tăng sinh vi khuẩn (16-18 giờ) trong 5 ml NB có chứa 1,5% NaCl. - Lấy 1,5 ml dung dịch vi khuẩn ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C rút bỏ phần dịch nổi, rửa viên kết tủa với 500 µl nước muối 0,9% NaCl và tiếp tục ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi. - Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút và lấy phần dịch nổi sử dụng cho phản ứng PCR (Pang et al., 2006).. - Nghiền nhuyễn mẫu và ủ ở nhiệt độ 100 o C trong 10 phút. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, lấy phần tủa DNA và để khô ở nhiệt độ phòng. - Qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi: Sử dụng các đoạn mồi P1: 5’-ATCATGGCTGCTTCACAGAC-3’, P2:. - 5’-CGCTGGAGAGGACAAGACAT-3’, P3: 5’- TCTTCATCAGATGCTACTGC-3’, P4: 5’- TAACGCTATCCAGTATCACG-3’ phát hiện WSSV (Kimura et al., 1996) và đoạn mồi F6: 5’- TGGATGTAAATGAGTTTGG-3’ và R4: 5’- CGTTACGATTATTTGATAG- 3’ phát hiện Vibrio harveyi (Sun et al., 2009).. - Qui trình được thiết kế bao gồm hai bước với các thành phần hóa chất tham gia phản ứng: (i) Bước 1: 1X PCR buffer, 1,5 mM MgCl 2 , 200 μM dNTPs, 20 pmol mồi P1 và mồi P2, 10 pmol mồi F6 và mồi R4, 2,5U Taq DNA polymerase. - 200 pg/μl DNA-WSSV, 200 pg/μl DNA-Vibrio harvey, tổng thể tích cho phản ứng là 25 μl. - (ii) Bước 2: 1X PCR buffer, 1 mM MgCl 2 , 200 μM dNTPs, 20 pmol mồi P3 và mồi P4, 10 pmol mồi F6 và mồi R4, 2,5U Taq DNA polymerase, 1 μl sản phẩn PCR bước 1 và tổng thể tích cho phản ứng là 25 μl.. - Điều kiện phản ứng bước 1 và bước 2: 94ºC trong 5 phút, tiếp theo 94ºC trong 30 giây, 56ºC. - Điện di: Sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 1,5% có chứa 0,5 µg/ml ethidium bromide, trong dung dịch 0,5X TAE (Tris- acetate-EDTA) ở 90V và ghi nhận với thiết bị chụp, xử lí ảnh geldoc XR (Biorad).. - Đọc kết quả: Kích thước sản phẩm PCR được xác định dựa vào thang ADN 100bp (Promega) hoặc thang ADN 1kb plus (Invitrogen) với: (i) Vibrio harveyi có vạch sản phẩm 159 bp. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Qui trình PCR đơn phát hiện vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi. - Qui trình PCR đơn được thực hiện để khẳng định mẫu vi khuẩn dùng cho nghiên cứu là Vibrio harveyi. - Kết quả điện di ở Hình 1 cho thấy sản phẩm PCR có kích thước 159 bp, đặc hiệu cho vi khuẩn Vibrio harveyi. - Từ kết quả này có thể sử dụng chủng vi khuẩn T2007-05 cho quá trình chuẩn hóa qui trình mPCR phát hiện đồng thời Vibrio harveyi và WSSV. - Bên cạnh đó, kết quả còn cho thấy qui trình PCR đơn có khả năng phát hiện vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm sử dụng DNA ly trích từ vi khuẩn.. - Hình 1: Kết quả PCR phát hiện Vibrio harveyi Giếng M: Thang đo DNA 1kb plus. - Giếng 1: Mẫu dương tính với Vibrio harveyi (159bp). - 3.2 Qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi. - Qui trình mPCR bước 1 phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio haryei: Qui trình PCR phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi bước đầu được xây dựng dựa vào nhiệt độ và thời gian gắn mồi. - của WSSV, kết quả cho thấy bảng gel chỉ hiện vạch của WSSV, không có vạch của Vibrio harveyi chứng tỏ đoạn gen mong muốn không được khuếch đại (Hình 2A).. - Nhiệt độ gắn mồi 56 o C không phù hợp cho DNA khuôn và mồi của Vibrio harveyi bắt cặp với nhau (Hình 2A) do vậy nhiệt độ gắn mồi được điều chỉnh thấp hơn là 54 o C. - Kết quả hình 4B cho thấy:. - khi nhiệt độ gắn mồi giảm xuống ở 54 o C, qui trình khuếch đại cho sản phẩm có vạch sáng rõ không có sản phẩm không đặc hiệu (Hình 2B).. - Hình 2: Kết quả mPCR bước 1 phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi. - (A) Nhiệt độ gắn mồi 56 o C, (B) Nhiệt độ gắn mồi 54 o C Giếng M: Thang đo DNA. - Nhiệt độ gắn mồi có vai trò rất quan trọng trong phản ứng PCR, nếu sử dụng nhiệt độ không phù hợp trong giai đoạn khuếch đại sẽ dẫn đến việc đoạn mồi không gắn vào mạch khuôn hay gắn một cách tùy tiện dẫn đến không xuất hiện vạch sản phẩm hay xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu.. - Nếu sử dụng nhiệt độ gắn mồi quá cao sẽ có rất ít sản phẩm được tổng hợp, nguyên nhân là do sự bắt cặp của đoạn mồi bị giảm đồng thời và xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu do khuếch đại bất đối xứng giữa các đoạn sản phẩm (Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008). - Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào độ lớn và nhiệt độ nóng chảy của mồi. - Như vậy, điểm điều chỉnh cần thiết ở qui trình PCR bước 1 là ở nhiệt độ gắn mồi giảm xuống còn 54 o C so với qui trình như dự kiến ban đầu.. - 20 pmol mồi P1 và mồi P2. - 10 pmol mồi F6 và mồi R4. - 2,5 U Taq DNA polymerase. - mẫu chiết tách (hay 200 ng/µl/phản ứng) và tổng thể tích cho 1 phản ứng là 25 µl. - Điều kiện phản ứng: 94 o C trong 5 phút. - cuối cùng 72 o C trong 5 phút.. - Qui trình mPCR bước 2 phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi: Sử dụng sản phẩm bước 1 để làm khuôn cho thực hiện phản ứng bước 2.. - Nhiệt độ gắn mồi 54 o C cho kết quả tốt ở bước 1 nhưng ở bước 2 lại xuất hiện các vạch sản phẩm không đặc hiệu (Hình 3A). - xảy ra ở 55 o C và sản phẩm phụ giảm về số vạch và độ sáng (Hình 3B). - Việc giảm thấp nhiệt độ gắn mồi có thể dẫn đến hiện tượng những nucleotide đơn bắt cặp nhầm hoặc mồi gắn với trình tự khác đích (Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008).. - Bên cạnh nhiệt độ gắn mồi thì thời gian gắn mồi, nồng độ Taq DNA polymerase, MgCl 2 , dNTPs, nồng độ mồi, nồng độ DNA,… không thích hợp sẽ ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR.. - Do vậy, qui trình được điều chỉnh ở các thành phần phản ứng.. - Hình 3: Kết quả mPCR bước 2 phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi (A) Nhiệt độ gắn mồi 54 o C, (B) Nhiệt độ gắn mồi 55 o C, (C) Chuẩn hóa thành phần phản ứng. - Giếng 1: Mẫu dương tính với WSSV (570 bp) và Vibrio harveyi (159 bp) Qui trình lần lượt được thử nghiệm điều chỉnh:. - (i) ở thời gian gắn mồi giảm từ 30 giây xuống 20 giây. - (ii) giảm hàm lượng sản phẩm PCR bước 1 còn 0,5 µl. - (iii) giảm nồng độ MgCl 2 1,0 mM nhưng kết quả vẫn không tốt. - Theo Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải (2008), thời gian gắn mồi dài cũng là nguyên nhân dẫn đến xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. - Đồng thời, nồng độ khuôn DNA cao thường tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp là tới hạn, nên dùng nồng độ DNA khuôn tối đa cho phép cùng với số chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỉ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu. - Ion Mg 2+ có vai trò rất quan trọng trong phản ứng PCR ngoài vai trò xúc tác Taq DNA polymarse trong quá trình kéo dài mồi và khuôn còn có tác dụng tạo sự bền hóa mối tương tác giữa oligo và khuôn, nhưng nếu nhiều ion Mg 2+ làm tăng hiệu suất thu hồi sản. - phẩm không đặc hiệu.. - Mồi là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của phản ứng PCR, mồi phải được thiết kế đặc trưng cho trình tự cần khuếch đại, độ dài mồi thường 15-30 nucleotide, lượng GC phải đạt 40-60. - Tỉ lệ giữa mồi và khuôn cao sẽ cho kết quả khuếch đại không đặc hiệu, tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. - Do vậy, qui trình PCR bước 2 được thử nghiệm điều chỉnh giảm nồng độ mồi xuôi P3, mồi ngược P4 từ 20 pmol xuống 10 pmol. - Kết quả ghi nhận ở hình 3C cho thấy qui trình cho phép khuếch đại cả vạch sản phẩm đặc hiệu của WSSV (570bp) và Vibrio harveyi (159bp). - Các vạch sản phẩm sáng và rõ, đồng thời không còn các sản phẩm không đặc hiệu (Hình 3C). - Do đó, khi giảm nồng độ mồi từ 20 pmol xuống 10 pmol cho kết quả mong muốn và không còn sản phẩm không đặc hiệu (Hình 3C).. - Kết quả chuẩn hóa thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 2 bao gồm: 1X PCR buffer. - 10 pmol mồi P1 và mồi P2. - 2,0 U Taq DNA polymerase. - 0,5µl sản phẩm PCR bước 1 và tổng thể tích cho 1 phản ứng là 25 µl. - Điều kiện phản ứng bước 2 bao gồm: 94 o C trong 5 phút, tiếp theo lặp lại 30 lần của 94 o C trong 30 giây, 55 o C trong 20 giây, 72 o C trong 1 phút, và cuối cùng 72 o C trong 5 phút.. - Qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời WSSV và Vibrio harveyi được phát triển và chuẩn hóa một số thành phần tham gia phản ứng như nồng độ MgCl 2 , Taq DNA polymerase, mồi, khuôn, nhiệt độ và thời gian gắn mồi. - Kết quả ghi nhận qui trình mPCR cho phép phát hiện đồng thời vi khuẩn gây bệnh phát sáng Vibrio harveyi và WSSV, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và có tính chính xác cao. - Do vậy, có thể ứng dụng các qui trình này vào trong chẩn đoán bệnh tôm giống, tôm nuôi một cách nhanh chóng, tính đặc hiệu cao.. - characterization, morphogenesis and pathogensis of white spot syndrome virus.. - Improved One- step Colony PCR detection of Vibrio harveyi. - Identification of Vibrio harveyi using PCR amplification of the toxR gene. - The White spot syndrome virus DNA genome sequence.